基于Angiosperms353目标测序的马达加斯加Bulbostylis（Abildgaardieae，Cyperaceae）系统基因组学物种边界与关系解析

《Plant Systematics and Evolution》：Phylogenomic insights into species boundaries and relationships in Malagasy Bulbostylis (Abildgaardieae, Cyperaceae) using Angiosperms353 target sequencing

　　

仅基于形态特征的物种划分在形态高度变异或难以研究的类群中具有挑战性。在此类情况下，分子数据可用于检验基于形态的分类处理的稳健性。在莎草科（Cyperaceae）中，系统基因组研究有助于澄清属级及以上阶元的亲缘关系与分类单元界定，但许多属（尤其是毛莎草属（Bulbostylis，hairsedges））的物种界定与关系仍缺乏记录。Bulbostylis是形态多样且分类复杂的类群，马达加斯加是其特有中心之一。由于稳定诊断性状稀缺及分子数据缺失，该属内的物种界定长期受阻。为评估马达加斯加Bulbostylis物种是否对应于不同的进化谱系，研究人员对1805年至2023年间采集的102份标本（包括标本馆标本与硅胶干燥材料）测序了353个核基因座（Angiosperms353）。去除测序成功率低的样品后，保留代表25个物种的64份材料。靶标序列捕获数据采用标准系统基因组学方法分析，包括序列比对、最大似然基因树推断，以及采用最大似然与多物种溯祖汇总方法进行物种树推断。系统发育分析恢复了13个得到良好支持的分支，对应于目前基于形态特征认可的分类单元（B. andringitrensis、B. barbata、B. erectopallescens、B. festucoides subsp. bathiei、B. filamentosa、B. firingalavensis、B. hispidula、B. mahafalensis、B. micranthera、B. renschii、B. schoenoides、B. tristicha、B. viguieri），并突显了可能的萌芽物种形成案例，即在物种树中B. trichobasis嵌套于B. andringitrensis内部。研究人员识别出与B. flaccidula和B. pseudocollina密切相关的潜在未描述分类单元，而另外10个物种因数据可用率低或无数据需进一步研究。补充采集新鲜材料并结合其他标本馆标本的测序与分析，对于全面理解这些谱系的物种界定十分必要。这些结果间接表明，花序结构、颖片形态、叶鞘和小坚果特征等形态特征在马达加斯加Bulbostylis的物种鉴定中仍高度可靠。

该研究发表于《Plant Systematics and Evolution》。研究背景方面，物种是理解生物多样性起源、维持与分布的基本单元，但物种定义与界定标准仍是生物学中持续存在的概念性挑战。尽管理论不断完善，但由于不同谱系受多样的进化、形态与生态过程塑造，单一物种定义无法一致适用于整个生命之树，杂交、不完全谱系分选及分子信号不一致等实证复杂性进一步模糊了许多类群的物种边界。系统基因组学方法的快速扩展改变了物种界定研究，基因组规模数据提升了检测进化独立性、解决浅层分化、量化基因流及揭示被形态同塑性掩盖的隐存多样性的能力，从而通过实现跨研究更一致、可重复的物种界限评估，复兴了分类实践。然而尽管方法取得进展，基因组数据集仍仅被纳入少部分物种界定研究中，且在分类群与生物地理区域间存在显著差距。在被子植物中，物种界定采用了从经典形态标准到整合形态、分子、生态与地理证据的综合框架等多种概念与方法，近期发展包括在多物种溯祖模型（multispecies coalescent model）下分析数百至数千个基因座的系统基因组研究，以及基因组、表型与生态数据集的AI辅助整合。然而被子植物系统基因组研究仍严重偏向高级阶元系统学，主要关注属与族间关系而非物种界定与关系，这一模式在菊科（Asteraceae）、大戟科（Euphorbiaceae）与蔷薇科（Rosaceae）等诸多科中均很明显。莎草科（Cyperaceae）研究也遵循同一趋势：先前的系统基因组研究极大澄清了族与属间关系，构建了该科稳健的骨干系统发育，并揭示了C₄莎草间的遗传趋同案例，但物种级系统基因组界定几乎完全未被探索，在马达加斯加尤为如此，尽管这一生物多样性热点拥有超过310种莎草分布于24属，其中Cyperus、Carex L.、Scleria P.J. Bergius与Bulbostylis是岛上物种最丰富的类群之一。莎草科的广泛系统发育工作为理解该科在马达加斯加的进化提供了总体框架，研究显示Cyperaceae谱系约自40 Ma前定殖该岛，伴随多次较近的扩散事件，并识别出约20个特有谱系，其中仅6个包含超过5个物种。其中Bulbostylis Kunth（1837）是泛热带属，全球约含221个接受种，主要多样性中心在南美与非洲，形态多样，从小型一年生至丛生多年生，顶端花序可为伞形、头状或单小穗，颖片螺旋或二列排列，小坚果倒卵形至倒梨形、钝三棱形或罕为背腹扁平透镜形，表面具各种纹饰或罕光滑，所有物种叶鞘口具白色长毛簇，唯B. andringitrensis Cherm除外。该属曾因Nemum Desv.被视作独立属而呈并系，但后续纳入Nemum的分析支持Bulbostylis的单系性。近期研究持续扩展对该属的认识，在南美与马达加斯加均有新种描述。马达加斯加是毛莎草的特有中心之一，分布于全岛所有主要植被类型，干旱开阔生境多样性最高，该辐射是岛上莎草科第二大特有辐射，也是C₄谱系内唯一的大的辐射。尽管如此，马达加斯加Bulbostylis在分子层面几乎未被研究，迄今无专门针对马达加斯加Bulbostylis的系统发育研究（无论少数基因座或基因组规模数据），仅有一例Angiosperms353序列被纳入更广泛的Cyperaceae分析中。Bulbostylis缺乏分子数据限制了系统发育推断与该属稳健的属下分类构建，因此其分类几乎完全基于形态。与许多植物类群一样，采集努力不均，部分物种在标本馆中有良好代表，而其他仅知极少标本（有时仅为模式），阻碍了物种界定的推断。现有两部主要分类处理为Chermezon的《Flore de Madagascar》（1937，认可21种，17种特有）与近期修订（Rasaminirina等，审稿中，认可28种，含22种特有），两者主要在总体上一致，暗示许多基于形态的物种界定具稳健性，但部分分类群地位不确定，可能仅能通过详细遗传分析解决。某些物种诊断形态性状清晰独特，如B. andringitrensis Cherm.叶鞘口无长白毛，B. arnsteinii Rasam.缺叶片，B. tristicha Lye ex Rasam.是唯一具三列颖片的物种，但此类明确性状并非一致可用，若干物种由极有限的可能同塑性状界定，引发其有效性疑问。例如B. decaryi Cherm.与B. micranthera Cherm.在《Flore de Madagascar》中仅以雄蕊数目区分，而该性状在B. densa（Wall.）Hand.-Mazz.等其他物种中已知可变，因此Rasaminirina等（审稿中）将B. decaryi异名于B. micranthera；类似地，B. hensii（C.B.Clarke）R.W.Haines与B. hispidula（Vahl）R.W.Haines据习性差异区分，但因B. hispidula高度可变且两物种均具脱落花柱基，Rasaminirina等（审稿中）将B. hensii异名于B. hispidula。这种情况因分子系统发育数据稀缺而加剧，严重限制了对形态界定分类群是否代表不同进化谱系的评估。为此，研究人员应用为被子植物开发的靶标捕获测序方法（Angiosperms353）研究马达加斯加Bulbostylis的系统发育关系与物种界定。该方法使用探针组富集任何被子植物中353个保守低拷贝核基因座，可产生跨分类群大量可比对的直系同源标记集，提供比质体或核糖体标记高得多的系统发育分辨率，且已被证明对标本馆材料高度有效，非常适合本研究（许多物种仅知于历史标本）。本研究是首次对马达加斯加Bulbostylis进行物种级系统基因组评估，核心问题是：现有两种基于形态的分类处理中认可的物种在用基因组规模数据评估时是否形成单系群？为此研究人员检验同一物种标本是否形成良好支持分支，并推断马达加斯加Bulbostylis物种间系统发育关系。

主要关键技术方法方面，研究人员于2019至2023年在马达加斯加野外采集硅胶干燥叶样标本，并向巴黎标本馆（P）申请测序未在安塔那那利佛（TAN）与邱园（K）获得的模式及馆藏标本，共新测序101份Bulbostylis标本与1份近缘属Fimbristylis Vahl标本，涵盖Chermezon（1937）处理的全部21种及Rasaminirina等（审稿中）认可的28种中除B. paucespicata外的所有种，每物种采样1至5份（B. hispidula采10份），并纳入Larridon等（2021a）的B. andringitrensis序列数据。DNA提取采用改良CTAB法处理标本馆与硅胶干燥茎叶组织，文库构建采用KAPA DNA Prep kit，靶标富集使用MyBaits Angiosperms353探针组，杂交后测序产成双端150 bp读段。原始读段经Trimmomatic质量修剪，使用HybPiper v2.3.2以修改版Angiosperms353目标文件（加入Bulbostylis参考序列）进行靶区组装，保留supercontigs（CDS＋侧翼区）。超级重叠群（supercontigs）用MAFFT v7.526比对，CIAlign v1.1.4清理，以Fimbristylis_sp_Tiley_143_2022为外群生根。用IQ-TREE v2.3.6基于ModelFinder选最佳替换模型推断338个基因座的基因树（15个基因座因组装或比对清理丢失），以Weighted ASTRAL v1.20.3.7基于338棵基因树推断物种树，排除恢复靶基因少于10个的标本，同标本双测序保留恢复最高者，最终物种树含65份标本（含外群），用IQ-TREE v2计算位点一致性因子（site concordance factors，sCF），所有分析在Crop Diversity HPC完成。

研究结果部分保留小标题并说明如下。

测序成功与基因恢复。102份测序标本中64份恢复超10个基因，总测序成功率63%，所有硅胶干燥叶样成功测序，基因恢复262至322个，平均86%；标本馆标本变异性更大，1800至1995年22份无基因恢复，最高319个，平均10%。线性建模显示标本年龄与来源对基因恢复有显著影响，基因恢复随标本年龄每年下降0.49%，模型解释44%变异（R²＝0.437），残差标准误29.41；相比TAN标本馆，K标本馆高32.3%，P高22.4%，硅胶干燥高29.6%。

马达加斯加Bulbostylis的物种界定。核系统发育树恢复13个良好支持分支（局部后验概率lpp＞0.9）对应于Rasaminirina等（审稿中）认可的物种水平谱系：Bulbostylis andringitrensis、B. barbata、B. erectopallescens、B. festucoides subsp. bathiei、B. filamentosa、B. firingalavensis、B. hispidula、B. mahafalensis、B. micranthera、B. renschii、B. schoenoides、B. tristicha、B. viguieri；额外恢复B. itremoensis分支支持较弱（lpp＝0.54），终端物种级分支多具中高sCF，常超70，部分超90（如B. barbata、B. erectopallescens、B. lateritica、B. mahafalensis）。七物种（B. abortiva、B. arnsteinii、B. heterostachya、B. lateritica、B. perrieri、B. thouarsii、B. varionux）因各仅一标本无法评估单系性。四物种在树中未显单系：三份B. trichobasis围绕B. andringitrensis成级序；B. varionux、B. flaccidula、B. cf. flaccidula围绕B. renschii成级序，sCF中等；B. pseudocollina两份成良好支持分支，第三份（B_cf_pseudocollina_LUR_18_2013）与B. tristicha聚在一起；B. psammophila四份中三份成良好支持分支与该支及B. trichobasis＋B. andringitrensis支成群，第四份（Lye_21076_1995）以弱支持（lpp＝0.51）为两姐妹支之外姐妹群。

马达加斯加Bulbostylis的系统发育关系。系统发育树将多数物种分入三分支（A、B、C），B. barbata（D支）为A＋B＋C姐妹群，小第五支（E支，B. erectopallescens＋B. lateritica）为其余所有物种姐妹群，这些关系均最大支持（lpp＝1），但深层节点sCF普遍低（sCF＜50）。A支含B. hispidula、B. itremoensis、B. thouarsii、B. andringitrensis、B. trichobasis、B. psammophila；B. andringitrensis与B. trichobasis最大支持成群，B. psammophila与此对关系中支持中等（lpp＝0.8）；B. thouarsii与B. itremoensis中等支持（lpp＝0.85）为姐妹，与B. hispidula关系弱支持（lpp＝0.6），深层伴中低sCF。B支为A姐妹，含B. viguieri与B. firingalavensis为姐妹，B. filamentosa、B. micranthera、B. abortiva、B. schoenoides依次围绕，所有关系最大支持且sCF高。C支为A＋B姐妹，含两最大支持亚支：第一亚支B. flaccidula与B. varionux依次围绕B. renschii（lpp＝0.81），B. heterostachya与B. festucoides subsp. bathiei依次围绕B. perrieri与B. arnsteinii最大支持；第二亚支B. mahafalensis为B. tristicha与B. pseudocollina最大支持支的姐妹，深层伴中等sCF。

讨论部分总结如下。测序成功与基因恢复方面，马达加斯加Bulbostylis总体63%成功率与其他Cyperaceae及禾草单子叶植物靶向序列捕获一致，基因恢复主要受标本年龄、干燥条件与保存历史影响而非科特异性，线性建模显示与标本年龄及存储地显著相关，TAN低于K与P，约半数变异未解释，证实标本处理或存储前干燥条件等其他因素可能影响，硅胶干燥样本表现最佳，符合近期采集快速干燥组织DNA完整性更高的发现，标本馆变异性大符合随时间DNA降解进程，虽有多种古DNA类策略提升高度降解标本DNA回收，但比较研究显示未必改善达最小测序阈值后的系统基因组性能，因此针对性重新采集硅胶干燥材料是确保高基因恢复与稳健系统基因组推断的最可靠策略。设定最少10个恢复基因阈值排除极不完整数据以免削弱分辨率与支持，同时保留代表马达加斯加多数Bulbostylis多样性的64份材料，平衡分类覆盖与数据质量，遵循Brewer等（2019）建议，严格过滤导致所有B. aureoglumis、B. festucoides subsp. Festucoides、B. xerophila样本被排除，需从新采集硅胶干燥材料重测序以确保足够基因组覆盖以稳健物种界定；七物种仅单份需增补采样确认界定；仅知两份B. paucespicata标本（含模式）未及时纳入，需两者及可能的新采集以确认分类地位与系统关系。系统基因组对诊断形态性状的支持方面，本研究框架清晰支持传统用于马达加斯加Bulbostylis物种界定的若干诊断形态性状的分类相关性，如良好支持的B. hispidula谱系证实了脱落花柱基（deciduous style-base）性状的分类信息价值，尽管其为形态复杂种具多变种与亚种实体，其分子凝聚表明该性状即使在形态异质性集合中仍保留强系统发育信号，类似Cyperaceae其他案例。B. micranthera与B. decaryi案例进一步说明系统基因组证据可强化真正形态共同衍征解释，两分类群形态高度相似共享习性、花序结构、颖片形态与小坚果纹饰等多性状，在系统发育分析中成单良好支持分支（B支），无分子分化支持这些共享性状为代表继承共同衍征而非趋同相似，佐证近期将B. decaryi异名于B. micranthera的处理，类似模式见于Cyperus、Lupinus、Astragalus、Quercus等，表明受基因组规模数据评估时成套相关形态性状反映共享进化史，支持系统学共识：系统基因组不否定形态作为物种界定基础，而是澄清哪些性状应保持分类意义，在Bulbostylis中受基因组规模数据支持的物种级实体倾向于对应稳定整合性状组合而非单一高变性状，符合综合物种概念（integrative species concepts）强调独立证据线一致性而非依赖单一数据源。非单系、系统基因组冲突与进化意义方面，若干非单系最好以物种内形态变异、采样不均与冲突的系统基因组信号解释而非分析假象或鉴定错误。B. cf. pseudocollina一份未与其余聚群伴随颖片形状与先端形态明显形态差异（典型颖片长渐尖缺失），形态不连续映现其系统放置并由sCF支持分离，类似Cyperaceae与被子植物其他类群内形态异质性对应系统基因组揭示的谱系级分化。相反B. trichobasis在树中级序不伴形态异质性，B. andringitrensis嵌套于其集合内但两分类群在花序结构、叶鞘性状、小坚果纹饰及生态地理分布上截然不同，相关节点sCF中等表明实质系统基因组冲突尽管拓扑稳定，提示不完全谱系分选或近期分化而非形态误判导致级序，类似Quercus与Silene等数百基因座分析的植物辐射中形态可诊断种在浅系统深度未必严格单系。B. flaccidula–B. renschii复合体涉及近缘分类群生活史策略差异（B. flaccidula一年生，B. renschii多年生），系统中B. flaccidula模式标本以高支持为B. renschii姐妹，另一暂定B. cf. flaccidula位置不稳定但基因恢复高，历史上密切亲缘已被形态认可（Chermezon 1937将B. flaccidula作为B. renschii变种），分子结果确认密切关系同时突显生活史分化的进化意义，一年生与多年生转换在被子植物中常见且与生态转换和多样化相关，该群体为未来研究Cyperaceae繁殖策略进化提供前景。

结论部分翻译如下。

本研究提供了马达加斯加Bulbostylis物种关系的首次系统基因组评估。不同样品间测序成功率差异显著，标本年龄与保存来源对基因恢复有明显影响，硅胶干燥材料的恢复率显著高于标本馆标本。在物种水平上，系统基因组分析恢复了对应于目前认可物种的13个良好支持分支，表明形态界定与系统基因组数据总体一致。然而，由于采样有限无法评估七个物种的单系性，且在四个分类群（包括B. trichobasis、B. flaccidula、B. pseudocollina与B. psammophila）中观察到非单系模式。在更深系统发育水平，马达加斯加Bulbostylis物种构成三个主要分支，另有早期分化谱系。虽然部分分支内关系得到强力支持，但更深节点伴随较低位点一致性因子，表明位点间存在冲突信号。综上，这些结果识别出需要进一步研究的分类群与物种复合体，并强调了采样与数据恢复对系统基因组推断的影响。本文提供的数据集为马达加斯加Bulbostylis提供了新的分子数据，并为未来结合扩展采样与额外基因组数据以改善物种界定与系统发育分辨率（包括在更广地理背景下）的研究奠定了基础。