《Egyptian Journal of Biological Pest Control》：Antifungal capacity and field validation of native Bacillus subtilis strains for sustainable potato disease control
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**摘要**
**背景**：对可持续作物保护日益增长的需求，促使研究人员积极寻找化学杀菌剂的有效生物替代品。本研究评估了从伊朗土壤中分离的本土枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）菌株对主要马铃薯病原菌（镰刀菌属 *Fusarium*、链格
**摘要**
**背景**：对可持续作物保护日益增长的需求，促使研究人员积极寻找化学杀菌剂的有效生物替代品。本研究评估了从伊朗土壤中分离的本土枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）菌株对主要马铃薯病原菌（镰刀菌属 *Fusarium*、链格孢属 *Alternaria*、疫霉菌属 *Phytophthora* 和核盘菌属 *Sclerotinia*）的生防潜力。在45个细菌分离株中，两个菌株（BS1-Kaolin 和 BS2-Maharloo）被分子鉴定为枯草芽孢杆菌，并因其优越的抗真菌活性而被选中。
**结果**：体外试验表明，BS1强烈抑制真菌生长（对尖孢镰刀菌 *F. oxysporum* 的抑制率达48%），而田间试验揭示了其双重功能：与对照组相比，块茎重量增加30–45%，块茎增殖增加18–27%（P?**结论**：本研究通过展示本土细菌菌株对目标病原菌的强效体外拮抗活性及其在田间条件下对马铃薯产量的积极影响，填补了具有抗真菌活性的本土细菌生防剂方面的重要空白。研究还表明，这些本土枯草芽孢杆菌菌株无需使用合成抗生素或抗真菌剂即可进行大规模生产，为马铃薯综合病害管理提供了一种实用且经济有效的方法。这些发现支持将这些环境友好型菌株作为可持续和有机马铃薯生产系统的替代品加以利用。
**论文解读：本土枯草芽孢杆菌菌株对马铃薯病害的可持续防控潜力**
**研究背景与问题**
马铃薯（*Solanum tuberosum* L.）是全球重要的主食作物，在伊朗也是粮食安全与农村经济稳定的关键。然而，真菌和卵菌病原体——包括链格孢属（*Alternaria* spp.）、镰刀菌属（*Fusarium* spp.）、疫霉菌属（*Phytophthora* spp.）和核盘菌属（*Sclerotinia* spp.）——分别引起早疫病、镰刀菌枯萎病、晚疫病和白霉病，导致马铃薯在种植和采后储存期间出现显著的产量与品质损失。传统防治主要依赖合成化学杀菌剂，但过度使用已引发环境污染、人类健康风险以及病原菌抗药性等问题。鉴于全球作物因病虫害每年损失20–40%，伊朗农业系统亦有类似情况，开发可持续的病害管理替代方案迫在眉睫。生物防治剂（BCA）和植物促生根际细菌（PGPR）因其环境友好且能抑制病原体、维持或提高产量而成为有前景的策略。枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）能产生多种抗真菌代谢物（如杆菌霉素、丰原素、表面活性素），并具有促生效应，但其效果依赖于菌株与当地农业生态系统的适应性。伊朗本土枯草芽孢杆菌的遗传多样性尚未充分挖掘，因此研究人员开展了此项研究，旨在从伊朗土壤中分离、鉴定本土 *B. subtilis* 菌株，评估其体外抗真菌活性，通过田间试验验证其防效，并优化生物量生产以实现规模化应用。该论文发表于《Egyptian Journal of Biological Pest Control》。
**主要技术方法（不超过250字）**
研究人员从伊朗阿尔达比勒、赞詹、阿萨勒姆、乌尔米耶、通卡邦、德黑兰、沙赫里科尔德、伊斯法罕和设拉子等地区的土壤样品中，经热休克处理（80°C，15分钟）后涂布于胰蛋白胨大豆琼脂上，分离获得45个细菌分离株。通过革兰氏染色、内生孢子染色、生化试验（淀粉酶、明胶酶、H?S产生、吲哚、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、运动性、MR-VP、耐热性）进行初步鉴定，并依据伯杰氏手册比对表型特征。同时，从伊朗纳夫奇、沙赫里科尔德和费雷丹等地的发病马铃薯组织（块茎和叶片）中分离致病真菌，经形态学鉴定确认为 *Fusarium*、*Alternaria*、*Phytophthora* 和 *Sclerotinia* 属，并通过马铃薯块茎接种试验（10? CFU/ml孢子悬液，25°C黑暗培养7天）验证其致病性。采用双培养法评估细菌分离株对真菌的拮抗作用：将真菌菌丝块置于平板中央，48小时后在距离3 cm处点接种细菌悬液（OD???=0.5），再培养48小时，计算抑制率。对最具抑制活性的菌株进行16S rRNA基因扩增（引物27F/1492R）和测序，通过NCBI BLAST比对鉴定为 *B. subtilis*。田间试验采用随机完全区组设计，在伊朗恰哈马哈勒-巴赫蒂亚里省进行，设置两个实验组（分别针对 *Alternaria* 和 *Fusarium*），每组包括5个处理：阴性对照、病原菌对照、单独生防菌、病原菌+生防菌、化学杀菌剂（醚菌酯）。收获后测定块茎数量、重量、地上鲜重与干重等参数。最后在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和营养肉汤（NB）中优化菌株的生物量生产与孢子形成，并在工业发酵培养基（大豆粉、葡萄糖等）中验证规模化潜力。
**研究结果**
**细菌分离**：从伊朗土壤中分离获得45个细菌分离株，部分经初步鉴定为 *Bacillus* 属物种，具体见表2。
**病原真菌分离**：从发病马铃薯组织中获得4个真菌分离株，经形态学鉴定分别属于 *Fusarium*、*Alternaria*、*Phytophthora* 和 *Sclerotinia* 属，并通过菌落色素、生长速率、产孢模式、隔膜、分生孢子形态等特征确认。
**真菌致病性体外评估**：所有分离的真菌菌株在实验室条件下对马铃薯块茎表现出致病性，*Alternaria* spp. 在接种后3–7天引起渐进性坏死病斑（图3）。
**细菌拮抗潜力**：45个分离株中，31个对四种病原真菌表现出显著拮抗活性。其中，菌株BS1（B31）平均抑制率最高（33.5?±?6.2%），BS2（B29）为25.5?±?2.4%，标准菌株 *B. subtilis* PTCC 1720为24.3?±?2.1%。BS1对尖孢镰刀菌（*F. oxysporum*）的抑制率达48%。
**最有效菌株的分子鉴定**：16S rRNA基因测序表明，BS1和BS2与参考 *Bacillus subtilis* 菌株序列一致性高，确认分类为 *B. subtilis*，序列已提交GenBank（登录号OQ343721和OQ343719）。
**田间条件下细菌拮抗菌对马铃薯真菌病害的评估**：
- **Group 1（*Alternaria* spp.）**：病原菌接种（T2）使总块茎产量显著降至760.8 g，而单独施用BS2（T3）虽总产量为528.8 g（因未直面病原菌），但获得了最高的块茎/植株比（8.8）和均衡的地上生物量。病原菌与BS2共接种（T4）使块茎数量从T2的35个增至54个，表明生防菌部分缓解了病害诱导的块茎败育。化学杀菌剂（T5）总产量最高（1209.8 g）。
- **Group 2（*Fusarium* spp.）**：病原菌接种（T2）严重削弱产量，总块茎重仅364.3 g；单独施用BS1（T3）获得640.1 g，为生物处理中最高，且与未处理对照（639.8 g）相当。BS1与病原菌共接种（T4）使产量较T2增加约75.6%，显著减轻了镰刀菌引起的损失。
**统计分析**：方差分析显示处理对块茎产量参数影响显著（P?**细菌生物量与孢子生产**：BS1在TSB中生物量积累迅速，第3天湿重达27.5 g/l，之后趋于稳定；内生孢子形成从第4天的8%逐渐增至第10天的95%。在TSB中，BS1湿重生物量最高达43.1 g/l，干重16.02 mg/ml，约为NB培养基的2倍。在工业发酵培养基中，BS1湿重38.1 g/l，干重9.4 mg/ml，略高于BS2（36.9 g/l，9.2 mg/ml），表明BS1具有更好的工业适应性。
**讨论与结论**
**讨论总结**：本研究发现，从伊朗土壤中分离的两个本土 *B. subtilis* 菌株BS1和BS2对马铃薯主要真菌病原体具有显著拮抗活性，且田间试验证实其能提高块茎产量和数量。病原菌接种试验确认了 *Alternaria* 和 *Fusarium* 的致病性，而细菌处理（尤其是BS1）表现出体外强抑菌效应和田间促产作用。这些结果与先前关于 *B. subtilis* 通过产生脂肽、挥发性有机化合物（VOCs）和裂解酶拮抗真菌的报道一致，也与伊朗本地分离株通过表面活性素抑制尖孢镰刀菌的研究相符。BS1和BS2的田间表现优于单纯病原抑制，还表现出促生效应，可能与植物激素、铁载体和ACC脱氨酶活性有关。值得注意的是，细菌处理产生的块茎数量多于化学杀菌剂处理，尽管后者绝对生物量更高，这支持了 *Bacillus* 菌株通过激素调节和营养动员促进块茎形成的观点。BS1在发酵条件下高生物量和高孢子形成率表明其适合规模化生产。
**结论翻译**：本研究证明，本土枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）分离株BS1和BS2是马铃薯（*Solanum tuberosum* L.）主要真菌病原菌的有效生防剂，同时能提高作物产量。从45个土壤来源细菌分离株中，BS1和BS2对关键植物病原真菌（包括镰刀菌属、链格孢属、疫霉菌属和核盘菌属）表现出最高的拮抗活性。通过16S rRNA基因测序进行的分类学鉴定确认这两个分离株均为 *B. subtilis*，该物种以其生防效能和植物促生（PGP）特性而广泛被研究。体外双培养试验显示，BS1对真菌菌丝生长具有显著抑制作用，尤其对尖孢镰刀菌效果最强。这些发现表明，分离株可能通过产生抗真菌次级代谢产物和竞争性排斥机制共同阻止病原菌增殖。所观察到的跨多个真菌属的广谱抑制活性，突显了其作为综合病害管理策略候选菌株的适用性。田间试验进一步证实了这些分离株的农学相关性。在病原菌胁迫下，BS1和BS2均能改善马铃薯表现，显著增加块茎数量和产量。尽管合成杀菌剂处理获得了最高的总块茎生物量，但细菌接种促进了更优的块茎增殖和植株活力，这与包含病原抑制和生长刺激的双重功能作用相一致。此外，BS1在发酵条件下表现出稳健的生物量积累和高效孢子形成，表明其具有适合生物制剂开发和商业规模生产的有利特性。总体而言，这些本土 *B. subtilis* 菌株代表了化学杀菌剂的环境友好且本地适应的替代品，值得将其整合到可持续的马铃薯病害管理计划中。
