上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）与三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer, TNBC）中免疫组成及细胞毒功能改变的相关性研究

《Breast Cancer Research》：Epithelial-mesenchymal transition is associated with altered immune composition and cytotoxic function in triple-negative breast cancer

　　

背景：上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）是一个动态过程，促进乳腺癌进展、转移和治疗抵抗，同时影响肿瘤免疫微环境（Tumor immune microenvironment, TIME），塑造免疫细胞浸润与功能。尽管完全上皮或完全间充质肿瘤状态的免疫学特征已被表征，但中间或部分EMT状态相关的免疫景观仍知之甚少。方法：为探讨EMT进展与免疫细胞组成及功能的关系，研究人员从三阴性4T1小鼠乳腺肿瘤细胞系中建立五个代表EMT表型谱的单细胞来源克隆群，并利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析这些克隆衍生的肿瘤。结果：源自这些克隆的肿瘤在体内保留其相对EMT状态，EMT进展伴随肿瘤免疫原性（tumor immunogenicity）的分级降低，以及免疫细胞组成与功能的改变。沿EMT谱系，肿瘤细胞表现为主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）I类和II类基因表达的渐进性下调，同时细胞毒性CD8+ T细胞浸润减少，关键效应与迁移基因（Gzmb、Ccr5、Cxcr6）表达降低。B细胞组成亦发生偏移，产生IgG1的浆细胞频率下降，调节样B细胞富集。自然杀伤（Natural killer, NK）细胞同样呈现渐进性功能抑制，表现为细胞毒分子表达减少及特定效应通路下调。结论：这些发现揭示EMT以分级方式关联免疫细胞招募与功能，为将EMT表型分型整合至治疗策略以克服乳腺癌免疫抵抗提供了依据。

研究背景与问题提出

上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）是胚胎发育、伤口愈合和癌症进展中高度保守的生物学过程，在癌症背景下促进肿瘤细胞失去顶端-基底极性和细胞间黏附等上皮特征，获得增强运动性、侵袭性和治疗抵抗等间充质特征。EMT并非二元开关，而是动态可塑的过程，细胞通过具有不同程度上皮和间充质特征的中间状态（称为部分或混合EMT）过渡，这些中间状态表现出增强的肿瘤起始能力，使集体迁移并增加转移风险。尽管大量研究表征了经历EMT的癌细胞内在特性及其与肿瘤微环境（Tumor microenvironment, TME）的相互作用，但多集中于完全上皮与完全间充质状态的比较，免疫细胞的浸润和功能如何沿完整EMT谱系（特别是部分EMT状态期间）改变仍知之甚少。为填补这一空白，研究人员利用分布于EMT谱系并在体内保留这些状态的鼠三阴性4T1乳腺癌细胞系的五个单细胞来源克隆群，使用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）进行转录组分析和计算分析，以表征与每种EMT状态相关的肿瘤微环境特征，探讨动态转变（特别是部分EMT状态）如何在肿瘤进展过程中促进免疫逃逸。

该研究论文发表于《Breast Cancer Research》。

主要关键技术方法

研究人员从三阴性（ER^-/PR^-/HER2^-）4T1小鼠乳腺肿瘤细胞系建立五个代表EMT谱系（上皮样E、三个中间态EM1/EM2/EM3、间充质M）的单细胞来源克隆群。将各克隆及亲本细胞原位植入雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫建立肿瘤模型，收获肿瘤组织后通过酶解消化获取单细胞，利用磁激活细胞分选（Magnetic-activated cell sorting, MACS）富集CD45⁺免疫细胞及总细胞群。对代表性肿瘤样本进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）建库与测序，利用Cell Ranger比对至mm10参考基因组生成基因-条形码矩阵，使用Seurat（v5.1.0）进行质控、归一化、降维（PCA、UMAP）与聚类，通过Harmony进行批次校正，依据经典标记基因及SingleR结合ImmGen数据集注释细胞类型，利用inferCNV推断拷贝数变异验证肿瘤细胞。采用76基因特征（76-gene signature, 76GS）、Kolmogorov-Smirnov（KS）统计量和多元线性回归（Multiple linear regression, MLR）方法计算EMT评分，通过Pearson相关性分析评估TACSTD2表达与EMT评分关系，并从TCGAbiolinks获取TCGA-BRCA（乳腺癌）数据筛选三阴性样本进行人鼠验证。

研究结果

Tumors derived from different EMT clones retained their original EMT states in vivo

为模拟乳腺癌EMT谱系，研究人员从4T1细胞系生成五个单细胞来源克隆群代表EMT谱系（E、EM1、EM2、EM3、M）。通过经典EMT标记（E-cadherin、vimentin、Snail、Twist1）免疫印迹评估克隆EMT状态。将各克隆及亲本4T1细胞原位植入小鼠，肿瘤生长动力学显示亲本和中间克隆EM2生长最快，上皮样克隆（E、EM1）中等，间充质样克隆（EM3、M）最慢。免疫荧光染色E-cadherin和vimentin显示，E衍生肿瘤高表达E-cadherin、低vimentin，间充质样克隆（EM2、EM3、M）衍生肿瘤呈梭形形态、E-cadherin降低、vimentin升高，vimentin/E-cadherin比值沿EMT谱系渐进性增加（线性回归P=8.2×10^-7），EM2比值异质性最大。结果表明不同EMT克隆衍生的肿瘤在体内大体保留其原始EMT相关状态。

Single-cell RNA sequencing identified distinct tumor and immune cell subpopulations in the tumor microenvironment

研究人员对每克隆衍生肿瘤的total tumor tissue及匹配CD45⁺免疫细胞进行scRNA-seq。整合UMAP可视化显示主要细胞群：肿瘤细胞（Epcam⁺ Cdh1⁺）、T/NK细胞（Cd3e⁺、Nkg7⁺）、B细胞（Cd79a⁺）、巨噬细胞（Adgre1⁺、Cd68⁺）、内皮细胞（Pecam1⁺）、成纤维细胞（Pdgfrb⁺），SingleR结合ImmGen验证聚类。inferCNV以T/NK和B细胞为参考，显示肿瘤细胞染色体不稳定性（广泛扩增缺失），区分恶性与非恶性细胞。肿瘤细胞重新聚类UMAP显示不同EMT克隆来源的细胞形成相对离散簇，亲本细胞形成独立簇，部分簇含多克隆细胞，表明EMT状态转录特征稳定驱动分隔，但存在表型可塑性和瘤内异质性。

Gene expression profiling of tumors from different clonal EMT states reveals epithelial and mesenchymal markers and immune evasion mechanisms

从scRNA-seq数据集分离肿瘤细胞，用76GS法计算单细胞水平EMT评分，E克隆评分最高（上皮特征），间充质样克隆评分渐进降低，与免疫荧光一致。KS和MLR法评分与76GS高度相关，验证EMT状态分类稳健；与TISMO数据库81个未处理亲本鼠乳腺肿瘤样本比，中间及间充质克隆肿瘤细胞位于更宽EMT谱系中间位，提示体内可能采用混合/部分EMT表型。UMAP分析显示五个渐变转录状态（上皮到间充质梯度），中间态形成两极间梯度。E克隆高表达上皮标记（Cdh1、Epcam、Cldn4、Cldn7），低间充质标记（Vim、Snai1）；M克隆高表达Gpnmb（与MMP基因共上调、促转移及免疫逃逸）和Mmp11。沿EMT谱系肿瘤细胞主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）I类和II类分子渐进下调，提示抗原提呈受损潜在限制免疫识别。Tacstd2（编码TROP2）在E克隆高表达，在鼠scRNA-seq及TCGA-BRCA三阴性人样本中与EMT评分正相关，提示TROP2表达沿EMT谱系变化可能影响TROP2靶向抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugates, ADCs）敏感性。

Distinct EMT states are associated with changes in T cell composition and cytotoxic gene expression

分析CD45⁺免疫细胞scRNA-seq，UMAP显示免疫谱系，T细胞（Cd3e⁺）分七亚群：细胞毒性CD8⁺ T细胞（Gzmb⁺ Cd8⁺ T，高Gzmb、Ccr7）、前体耗竭CD8⁺ T细胞（Lef1⁺ Cd8⁺ T，共表达Tcf7、Lef1、Pdcd1）、调节性T细胞（Tregs, Foxp3⁺ Cd4⁺ T）、Cd44^- Cd4⁺ T、Cd44⁺ Cd4⁺ T、增殖Mki67⁺ T、Trdc⁺ 双阴性（Double-negative, DN）T细胞（γδ T细胞）。T细胞比例沿EMT谱系（上皮到间充质）渐进下降，细胞毒性CD8⁺ T细胞比例降幅最显著，Tregs比例渐进增加；回归分析显示Gzmb⁺ CD8⁺ T比例显著降低（P=0.032），Tregs比例显著增加（P=0.044）。细胞毒性CD8⁺ T细胞中，间充质样肿瘤来源细胞较上皮样肿瘤来源细胞低表达Gzmb、Ccr5、Cxcr6（CCR5和CXCR6参与T细胞迁移滞留，Gzmb为细胞毒效应分子），表明向间充质EMT状态进展损害细胞毒性T细胞招募与功能活性，致微环境免疫原性降低。

Tumor EMT is associated with shifts in B cell subpopulations and progressive suppression of NK cell cytotoxic function in the tumor microenvironment

从免疫富集scRNA-seq数据识别B细胞（Cd19⁺），UMAP分四亚群：Cd44^- MHCIIhi B细胞、浆细胞、Cd25⁺ Cd69⁺ B细胞、Cd44⁺ Cd69⁺ B细胞。上皮样肿瘤（E、EM1）富集浆细胞且主要表达Ighg1（IgG1关联抗肿瘤B细胞应答），间充质样肿瘤（EM3、M）浆细胞比例显著减少或缺失；Cd25⁺ Cd69⁺ B细胞（4T1肿瘤中标记调节性B细胞Regulatory B cells, Bregs）在间充质样肿瘤（EM3、M）富集，Bregs通过T细胞耗竭等促免疫抑制。分离NK细胞评估，点积图显示上皮到间充质肿瘤NK细胞表达细胞毒及迁移相关基因（Gzma、Gzmb、Prf1、Cxcr6）水平和比例渐进降低；通路富集分析显示间充质样本NK细胞TNFα/NF-κB信号、IFN-γ响应、IL6-JAK-STAT3信号富集减少，中间EMT克隆非严格单调趋势，表明EMT进展伴随某些NK细胞毒效应程序逐步丧失，炎症及细胞因子响应在中间态异质调控。

讨论部分总结

EMT是癌症进展、转移和治疗抵抗的既定驱动因素，但其调节肿瘤-免疫互作的作用（尤其部分EMT状态）仍不完全清楚。本研究用4T1鼠TNBC模型不同EMT状态单细胞克隆探讨EMT进展如何影响TIME免疫景观，发现EMT状态与肿瘤细胞内在基因表达及浸润免疫细胞（T、B、NK）组成功能深刻改变相关。五EMT克隆转录不同，scRNA-seq离散簇；虽有些克隆肿瘤较TISMO数据集乳腺肿瘤细胞系处更中间EMT位，但保留体外相对EMT层级，免疫荧光和EMT评分一致，体内保留使能在受控遗传背景下评估定义EMT表型对免疫细胞浸润的影响。间充质样肿瘤细胞MHC I/II下调，与既往EMT关联抗原提呈受损及免疫原性降低一致，该下调可能通过限制细胞毒性免疫细胞识别激活促免疫逃逸。完全间充质端关联Tregs、M2巨噬细胞、耗竭CD8⁺ T细胞浸润增加，本研究新证据显示免疫抑制沿EMT谱系渐进发展：细胞毒性CD8⁺ T细胞浸润及效应基因（Gzmb、Ccr5、Cxcr6）渐进减少，Tregs相应增加，与MHC分子表达及肿瘤内在改变一致，提示免疫重塑部分沿EMT谱系渐进而非离散转变。研究揭示B、NK细胞区室沿EMT谱系的先前未识别改变：IgG浆细胞从上皮到间充质丰度渐进下降，Cd25⁺ Cd69⁺ 调节B细胞增加；最间充质肿瘤NK细胞细胞毒基因表达及TNFα/NF-κB、IFN-γ等效应通路富集降低，提示向间充质EMT进展关联免疫逃逸特征（肿瘤内在程序与周围免疫景观协调改变）。TACSTD2（TROP2）在上皮样克隆肿瘤细胞高表达，在鼠scRNA-seq及TCGA-BRCA三阴性人样本与EMT评分正相关；TROP2是Sacituzumab govitecan（FDA批准转移性TNBC ADC）靶点，但表达限于子集细胞且沿EMT异质分布，提示EMT可塑性可能降低靶可用性并影响TROP2导向疗法疗效，评估EMT状态与TROP2表达可细化TNBC患者ADC疗法分层。局限：源于单一鼠乳腺癌细胞系，推广至其他肿瘤类型/物种/遗传多样模型待定；人肿瘤异质性与混合部分EMT限制EMT单独预测TIME免疫组成/功能；未全面分析转移播散与免疫浸润联系；体内每EMT克隆单肿瘤可能限制推广及瘤间变异性捕捉，需增加生物重复验证；主要依赖scRNA-seq为假设生成观察，因果关系需诱导EMT系统或关键调节因子遗传操作功能验证，未来扰动EMT状态评估体内免疫影响及耗竭免疫区室评估免疫监视对EMT进展/异质性作用，厘清动态互作（TME诱导EMT，EMT调制免疫组成），需更准确捕获互作的模型揭示EMT驱动免疫调制机制。

结论部分翻译

总之，研究表明EMT状态与三阴性乳腺肿瘤微环境内免疫细胞组成及功能差异相关。通过塑造肿瘤细胞抗原可见性及免疫效应细胞招募与激活，EMT状态可能以状态依赖性方式影响肿瘤-免疫互作。这些发现强调了在免疫治疗设计与实施中考虑EMT状态的重要性，并为在侵袭性间充质样肿瘤中靶向EMT与免疫检查点的联合策略提供依据。