《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：Targeting the CAF-GDF15 axis attenuates AKT-mediated mitochondrial rewiring and chemoradiation resistance in esophageal adenocarcinoma
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摘要
背景：食管腺癌（EAC）的治疗抵抗在肿瘤-间质相互作用层面仍知之甚少。研究人员探究了癌症相关成纤维细胞（CAF）来源的信号是否通过分泌程序中的GDF15功能角色，促进EAC放化疗抵抗及不良临床结局。方法：依据CROSS方案，分析EAC患者新辅助放化
摘要
背景：食管腺癌（EAC）的治疗抵抗在肿瘤-间质相互作用层面仍知之甚少。研究人员探究了癌症相关成纤维细胞（CAF）来源的信号是否通过分泌程序中的GDF15功能角色，促进EAC放化疗抵抗及不良临床结局。方法：依据CROSS方案，分析EAC患者新辅助放化疗前后血清GDF15水平，并在独立队列及公共数据集中验证其预后相关性。利用原代EAC CAFs、EAC细胞系及患者来源类器官（PDOs），在二维和三维共培养体系中模拟肿瘤-间质串扰。通过区室特异性转录组和蛋白质组学分析鉴定CAF调控通路。采用GDF15基因敲除及抗体介导的中和实验评估其功能贡献，随后评价放化疗敏感性、线粒体功能、氧化磷酸化依赖性及AKT通路激活状态。结果：CROSS治疗后血清GDF15水平显著升高，且治疗后升高的GDF15独立预测EAC患者较差的总生存期。CAFs增强EAC细胞及PDOs对化疗和放疗的抵抗，伴随GDF15分泌增加。区室特异性转录组分析及ELISA支持CAFs是肿瘤-间质相互作用中可诱导GDF15的主要来源。GDF15基因敲除降低治疗抵抗，而重组GDF15部分恢复GDF15敲除模型中的化疗抵抗。GDF15中和减弱CAF相关顺铂耐受。机制上，GDF15促进AKT激活及线粒体呼吸适应，包括增强氧化磷酸化。药理学抑制氧化磷酸化进一步使EAC细胞对顺铂敏感，尤其在CAF共培养条件下。结论：该研究确定CAF来源的GDF15是EAC中一个具有临床相关性和功能靶向性的CAF分泌抵抗程序组分。GDF15参与AKT相关线粒体适应及肿瘤细胞对放化疗的耐受，而CROSS治疗后升高的血清GDF15可作为预后生物标志物。这些发现支持进一步研究GDF15靶向及线粒体靶向策略以克服EAC中CAF相关治疗抵抗。
论文解读文章
**研究背景**
食管腺癌（EAC）在全球范围内构成重大健康负担，2020年新发病例约60.41万例，死亡人数达54.4万。尽管多学科管理不断进步，EAC患者5年生存率仍仅约20%。手术联合新辅助化疗或放化疗（CROSS方案）是局部晚期食管癌的标准治疗策略，但治疗抵抗仍是临床难题。肿瘤微环境（TME）中的肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）通过旁分泌效应、诱导肿瘤细胞静止、富集肿瘤干细胞特性及调节代谢和免疫状态，在治疗抵抗中发挥关键作用。生长分化因子15（GDF15）是TGF-β超家族成员，其血清水平升高与多种肿瘤（包括EAC）不良预后相关，但GDF15在CAFs与EAC细胞相互作用中的具体分子功能尚不清楚。该研究旨在探究EAC CAFs通过分泌GDF15促进治疗抵抗的机制，并评估其预后价值。
**主要技术方法**
研究人员利用来自科隆大学医院和阿姆斯特丹大学医学中心的EAC患者样本，包括55例接受CROSS治疗的EAC患者配对血清（用于GDF15检测及预后分析）及5例原代EAC CAF细胞系（TBE60、TBE63、CAF2304、CAF2765、CAF3095）。通过Transwell二维共培养体系及基于Dome或Transwell的三维类器官共培养体系，模拟肿瘤-间质相互作用。采用RNA测序（RNA-seq）和蛋白质组学（LC-MS/MS）分析差异表达基因/蛋白，使用shRNA技术敲除GDF15，并利用中和抗体（α-h-GDF-15）进行功能验证。通过Seahorse XF细胞线粒体应激测试、TMRE染色及流式细胞术评估线粒体功能。主要技术包括：患者血清ELISA检测、原代CAF及类器官建立、共培养系统、转录组/蛋白质组学分析、基因敲除与抗体中和、线粒体呼吸功能测定。
**研究结果**
**1. 血清及组织GDF15在EAC中升高，CROSS治疗后高GDF15预示不良预后**
55例EAC患者CROSS治疗后血清GDF15水平显著升高（938.5 vs 1672 pg/mL，p<0.0001）。Kaplan-Meier分析显示，治疗后GDF15高表达组总生存期显著缩短（Log-rank=7.103，p=0.008），而治疗前GDF15水平无预后差异。多因素Cox回归确认治疗后高GDF15是独立预后因素（HR=2.782，p=0.037）。TCGA数据中EAC患者GDF15高表达与较差OS相关（p=0.025），且EAC组织中GDF15表达显著高于癌旁正常组织（GSE92396及医院队列验证）。
**2. EAC CAFs促进EAC细胞增殖及治疗抵抗，GDF15参与细胞间串扰**
Transwell共培养7天后，EAC细胞（OE33、OE19）增殖能力增强，对顺铂、奥沙利铂及放疗的抵抗增加（凋亡减少）。RNA-seq分析发现GDF15在CAFs中上调、在肿瘤细胞中下调，呈现相反表达模式。单细胞RNA-seq显示GDF15在EAC肿瘤细胞及成纤维细胞中高表达。公共数据库（GSE26886）证实EAC中GDF15表达显著高于食管鳞癌、Barrett食管及正常上皮。
**3. GDF15敲除降低EAC细胞治疗抵抗及CAF介导的耐药**
ELISA显示共培养后GDF15分泌显著增加，CAFs（尤其TBE63）是主要来源。GDF15敲除（shRNA）后，OE33/OE19细胞对顺铂、奥沙利铂及放疗敏感性增加，凋亡率升高。与GDF15敲除CAFs共培养时，肿瘤细胞耐药性减弱。重组GDF15（rGDF15）补充可部分恢复GDF15敲除细胞的治疗抵抗。
**4. CAF共培养及rGDF15增加EAC类器官治疗抵抗**
利用配对EAC类器官（PDOs）与CAFs建立Dome/Transwell共培养体系，CAFs促进PDO增殖（面积增大），并增强顺铂抵抗。rGDF15处理虽不促进增殖，但同样增强PDO对顺铂的耐药性。
**5. GDF15支持线粒体呼吸程序及线粒体适应**
蛋白质组学分析显示，GDF15敲除后线粒体呼吸链复合物亚基（NDUFB5、COA3）、线粒体氨酰-tRNA合成酶（HARS2）及代谢酶（ALDH6A1）等显著下调，rGDF15补充恢复。GO及GSEA分析富集氧化磷酸化（OXPHOS）、线粒体基因表达、活性氧等通路。Seahorse实验证实，CAF共培养增强EAC细胞基础呼吸、最大呼吸、ATP产量及备用呼吸能力，而GDF15敲除则显著抑制这些参数（包括顺铂应激下）。TMRE染色显示，顺铂处理引起线粒体膜电位升高（超极化），GDF15中和可部分降低此效应。低剂量寡霉素A（OXPHOS抑制剂）在CAF共培养条件下进一步增强顺铂敏感性。
**6. GDF15敲除减弱AKT通路激活**
KEGG分析显示CAF共培养富集PI3K-AKT信号通路。Western blot证实CAF共培养增加p-AKT（Thr308/Ser473）水平，而GDF15敲除CAFs共培养则降低p-AKT。AKT抑制剂VIII（AKTi）可逆转CAF共培养引起的线粒体功能增强及治疗抵抗。GDF15敲除后EAC细胞中p-AKT水平降低，顺铂处理下进一步加剧。单细胞RNA-seq显示GDF15经典受体GFRAL在EAC细胞中低表达或不表达，提示非经典机制。
**7. GDF15中和部分减弱CAF相关顺铂抵抗**
在TBE63条件培养基及Transwell共培养体系中，GDF15中和抗体（10 μg/mL）显著降低CAF对OE33细胞的保护作用，CCK8及流式凋亡检测均显示凋亡增加（p<0.05），但效果为部分逆转，提示其它CAF分泌因子协同作用。
**讨论与结论**
该研究首次利用配对EAC类器官与CAFs共培养体系，系统阐明CAF-GDF15轴在EAC治疗抵抗中的功能。GDF15作为CAF分泌抵抗程序的关键节点，通过激活AKT通路增强线粒体氧化磷酸化，促进肿瘤细胞对放化疗的耐受。CROSS治疗后血清GDF15升高可作为独立预后生物标志物，反映治疗相关应激。GDF15中和及OXPHOS抑制策略可部分逆转CAF介导的耐药，提示联合靶向GDF15与线粒体代谢的方案具有治疗潜力。研究局限性包括：未完全解析EAC中CAF异质性、缺乏体内验证、GDF15下游受体及分子机制未明确。未来需结合更大样本队列、空间转录组学及人源化小鼠模型，进一步验证GDF15靶向策略的临床转化价值。结论：该研究确定CAF来源的GDF15是EAC中具有临床相关性和功能靶向性的治疗抵抗中介，支持动态监测血清GDF15及开发GDF15/线粒体靶向治疗策略。
