SRLC技术的建立：一种用于酿酒酵母的多重基因组编辑技术及其在丙二酰辅酶A途径代谢工程中的应用

《Microbial Cell Factories》：Establishment of SRLC: a multiplex genome editing technology for Saccharomyces cerevisiae and its application in metabolic engineering of malonyl-CoA pathway

　　

摘要

先进的基因组工程工具的开发对于优化Saccharomyces cerevisiae的代谢途径以及实现高效生物制造至关重要。本研究提出了一种改进的S. cerevisiae多重基因组编辑策略，该方法结合了源自Escherichia coli的单链退火蛋白（SSAPs）与源自S. cerevisiae的同源重组酶（Rad51和Rad52）。该策略采用SSAP-Rad-线性化CRISPR（SRLC）平台，无需构建复杂的多gRNA表达载体即可高效同时编辑多个基因组位点。共同过表达Rad51/Rad52和E. coli SSAP蛋白可显著增强同源重组作用，从而通过短同源臂实现精确的多位点基因组编辑。此外，SRLC还利用线性化的CRISPR-Cas系统来促进同源重组，并在S. cerevisiae中实现反向选择，进而提高多重基因组编辑的精度。我们应用SRLC对S. cerevisiae中的丙二酸单酰辅酶A代谢途径进行了改造，经过一轮编辑和筛选后，成功构建了一个同时修饰9个目标基因的底盘菌株，其细胞内丙二酸单酰辅酶A含量增加了9.6倍。利用该底盘菌株，3-羟基丙酸的产量相比野生型S. cerevisiae提高了4.5倍。这一平台为S. cerevisiae的操控提供了强大且可扩展的工具，同时也为构建以丙二酸单酰辅酶A为生产目标的生物工厂提供了实用的途径设计策略。