β-内酰胺诱导的屎肠球菌小菌落变异株的延长的生长延迟期及可变的抗生素耐受性

《BMC Microbiology》：Extended lag phases and variable antibiotic tolerance in β-lactam-induced small colony variants of Enterococcus faecalis

　　

屎肠球菌的小菌落变异株与持续性感染相关，并且与抗生素敏感性和耐受性的改变有关。在此，研究人员研究了在β-内酰胺暴露下出现的SCVs，并与相应的正常菌落表型进行了比较。SCVs是在苄青霉素（benzylpenicillin）、头孢曲松（ceftriaxone）和联合治疗下体外生成的，并通过生长动力学、抗生素敏感性（MIC）、杀伤动力学（MDK）和杀菌活性（MBC）进行表征。使用大蜡螟模型进一步评估了毒力和感染动态。SCVs表现出降低的生长速率和延长的生长延迟期，这在传代培养后是部分可逆的。β-内酰胺暴露在多个谱系中诱导了MIC的显著增加，包括SCV和NCP变异株，表明敏感性降低代表了一种普遍的适应性反应，而不是表型特异性特征。相比之下，杀伤动力学揭示了异质性的耐受性谱，这与SCV的形成并不总是相关的。虽然选定的SCVs表现出延长的MDK值（与耐受性增加一致），但其他变异株尽管MIC升高，却表现出快速杀伤。MBC值进一步支持了这种解离，特别是对于头孢曲松，其杀菌活性在变异株中始终有限。在G. mellonella模型中，SCVs表现出感染发作延迟，但并不统一导致毒力降低。总之，这些发现表明，屎肠球菌中的SCVs代表了一种异质且可逆的适应状态。抗生素耐受性取决于生长动力学而不是仅依赖于表型，而MIC的转变独立于SCV的形成，这突出表明了区分耐药性、耐受性和表型适应的重要性。

在慢性感染中，细菌的持续存在往往归因于生物膜形成、逃避宿主免疫反应以及耐药和耐受亚群的出现。在这些亚群中，小菌落变异株因其生长缓慢、形态和代谢改变而成为治疗的重大挑战。与金黄色葡萄球菌SCVs研究充分的机制不同，屎肠球菌SCVs的相关知识较为匮乏，尽管其与感染性心内膜炎等持续感染相关。既往研究发现，β-内酰胺类抗生素压力下屎肠球菌生物膜能浓度依赖性地产生SCVs。为了进一步探究，研究团队开展了一项综合多组学的研究，论文发表在《BMC Microbiology》上。研究人员在表型、基因型和致病性水平上对β-内酰胺诱导的屎肠球菌SCVs进行了表征，揭示了它们代表一种高度异质性且可逆的适应状态，而抗生素耐受性主要依赖于生长动力学而非单一菌落表型，这对理解和治疗肠球菌持续感染具有重要意义。

在技术方法方面，研究人员选取了来自既往双β-内酰胺抗生素协同作用研究队列的临床心内膜炎屎肠球菌分离株26,786，并在苄青霉素与头孢曲松的压力下体外诱导SCVs。采用肉汤微量稀释法测定最小抑菌浓度，利用时间-杀伤试验测定最小杀伤时间（MDK90和MDK99）及最小杀菌浓度（MBC）。通过代谢物定量分析和生长曲线分析评估动力学特征。采用Galleria mellonella幼虫感染模型评估体内毒力与感染动态。最后，利用纳米孔全基因组测序和变异检出分析鉴定遗传突变。

**抗生素压力下的表型和形态变异**：通过将野生型菌株暴露于不同抗生素条件并在血琼脂平板上观察，研究人员分离出SCVs和NCPs。SCVs的菌落直径比NCPs小60%-75%，且在传代培养30天后表现出高度稳定性。未在SCVs中检测到对氯化血红素、维生素K3或胸苷的营养缺陷。结晶紫染色和显微镜观察显示不同表型间呈非均质性，未表现出与SCV表型一致的显著结构改变趋势。

**抗生素暴露驱动表型间头孢曲松MIC增加**：通过MIC分析发现，多数变异株对苄青霉素的MIC保持稳定，而在β-内酰胺暴露后，各谱系（包括SCV和NCP）的头孢曲松MIC普遍急剧上升。值得注意的是，SCV-PEN在不相关抗生素的选择下MICCRO从4 mg/L升至512 mg/L，这表明敏感性降低是一种普遍的适应性反应，而非SCV表型所特有。

**SCVs生长延迟但代谢变化极小**：代谢动力学分析显示，SCVs的乳酸和乙酸产生水平总体与NCPs相当，仅表现为早期乳酸堆积出现短暂的延迟。生长曲线分析揭示SCVs具有显著延长的生长延迟期（约2至3倍）以及适度降低的生长速率，这证明SCV表型主要由改变的生长动力学所决定，而非由于胞外代谢物产量的大幅变化。

**时间-杀伤试验揭示异质性耐受性谱**：为了评估抗生素耐受性，研究人员测定了各变异株在16× MIC下的MDK。在苄青霉素处理下，大多数变异株的杀伤时间没有显著差异。而在头孢曲松处理下，杀伤动力学表现出高度异质性。例如，仅SCV-CRO和SCV-PEN+CRO-MH表现出显著延长的杀伤时间，其他SCVs并未增加耐受性。结果表明MIC的增加并不必然伴随MDK的延长，抗生素耐受性依赖于特定环境与选择历史。

**SCVs中MBC值的变化**：杀菌活性测定表明，苄青霉素的MBC在变异株中基本保持稳定。而头孢曲松的MBC在所有变异株中均居高，反映出头孢菌素对肠球菌本来极低的杀菌活性。尤其是SCV-PEN的MBCCRO上升至2048 mg/L，NCP-0在测试范围内未能测出。这证实了MIC转移、杀菌活性和耐受性在不同表型间可能发生解离。

**幼虫中SCVs感染反应延迟**：通过Galleria mellonella幼虫感染模型，研究发现部分谱系（如SCV-CRO）的致死率发作呈现延迟，且在高接种量下具有统计学显著性。然而随时间推移存活率最终趋于一致。且不同表型幼虫的最终细菌载量并无显著差异，表明SCVs主要改变的是感染进程而非减弱总体毒力或增殖潜力。

**SCVs体内稳定性有限**：通过回收感染幼虫血淋巴进行分析，发现大多数SCV在体内发生了大规模向NCP表型的逆转，SCVs仅占总回收菌群不到10%。同时在NCP感染的幼虫中也观察到了频率极低（1-2%）的SCV自然发生，说明宿主体内环境也能诱导产生非稳定性的SCV亚群，且其动态变化高度依赖于细菌负荷绝对值。

**SCVs调节及应激反应通路突变鉴定**：对每个SCV进行全基因组测序变异检出，发现每个SCV仅含1至2个遗传突变，但影响了相似的调节及应激反应通路。包括SCV-PEN中调控细胞包膜应激及固有头孢菌素耐药的关键调节因子磷酸酶基因ireP的突变；影响双组分信号传导系统的组氨酸激酶基因arlS突变；以及参与严密反应的tyrS基因移码突变等，这表明了屎肠球菌通过多种基因和生理途径聚敛呈现SCV适应状态。

在讨论部分，研究人员总结强调，β-内酰胺抗生素压力筛选出的屎肠球菌SCVs不仅仅是形态学改变，它们在代谢、生长动态及抗生素耐受性上均表现出显著的异质性。与金黄色葡萄球菌经典营养缺陷型SCV不同，屎肠球菌诱导的SCV未表现出营养缺陷，标志着不同的适应机制。研究结果明确显示，MIC的增加、抗生素耐受性的增强以及杀菌活性的改变可以相互独立存在。延长生长延迟期是部分SCV表现出的特征，这可以引发“延迟耐受”，但并非所有SCV的普适特性。全基因组测序揭示了通过影响磷调节和氨基酸-tRNA充电造成的生长停滞能够促进该适应状态发生。总而言之，屎肠球菌中的SCVs应被视为一种动态的、依赖于具体环境的适应机制，而非单一的耐药或耐受机制，这对于临床区分耐药、耐受与表型适应、并制定针对持久性感染的治疗策略具有极为重要的指导意义。