《Neurology Genetics》：Defining Haplosufficiency in Autosomal Recessive Limb-Girdle Muscular Dystrophy Using Molecular Markers in Disease Carriers
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肢带型肌营养不良症（limb-girdle muscular dystrophy, LGMD）的常染色体隐性形式由双等位基因功能缺失变异引起。单倍体充足性携带者被假设具有足够的蛋白质表达以维持正常的身体功能。本研究旨在确定3种常染色体隐性LGMD亚型即LGMD
肢带型肌营养不良症（limb-girdle muscular dystrophy, LGMD）的常染色体隐性形式由双等位基因功能缺失变异引起。单倍体充足性携带者被假设具有足够的蛋白质表达以维持正常的身体功能。本研究旨在确定3种常染色体隐性LGMD亚型即LGMDR1（CAPN3, calpain-3）、LGMDR9（FKRP, FKRP）和LGMDR3（SGCA, α-sarcoglycan）的单倍体充足携带者中的相对蛋白质表达。此外，本研究阐明了LGMDR9携带者中的福谷蛋白相关蛋白（fukutin-related protein, FKRP）酶功能。患有LGMDR1、R9和R3的个体及相应携带者在体格检查后提供肌肉活检样本。进行RNA-seq分析以确定全局基因表达模式。使用RNA-seq标准化计数确定CAPN3、FKRP和SGCA的基因表达，并通过蛋白质印迹法（western blotting）确定疾病相关蛋白质的相对定量。研究发现LGMDR1携带者的总calpain-3表达约为非携带者对照的25%，而LGMDR9携带者的FKRP功能接近50%。LGMDR3携带者表现出与对照组相当的α-sarcoglycan和β-sarcoglycan蛋白质水平。数种常染色体隐性LGMD的携带者与非携带者对照相比，疾病相关蛋白质表达降低且相关蛋白质功能降低。由于这些单倍体充足携带者具有正常的体力，这种程度的蛋白质表达可能代表基因替代疗法后恢复单倍体充足状态的阈值。
研究背景方面，肢带型肌营养不良症（limb-girdle muscular dystrophy, LGMD）是一组共32种不同的肌营养不良症，临床特征为近端肌肉进行性无力，罕见遗传病的患病率约为1:14,500至1:23,000，而携带者频率预计高达1:150至1:211。目前尚无获批的LGMD基因疗法可供患者使用。大多数LGMD是由于抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合物（dystrophin associated protein complex）中蛋白质功能缺失所致，这些蛋白质提供结构支持及与骨骼肌肌节或层粘连蛋白基底膜（laminin-basement membrane）的适当连接。虽然少数LGMD病例为常染色体显性遗传，但绝大多数约90%遵循常染色体隐性遗传模式。本研究考察3种常染色体隐性LGMD亚型：LGMDR1（原2A型）、LGMDR9（原2I型）和LGMDR3（原2D型）。LGMDR1由CAPN3基因的双等位致病性变异引起，编码肌肉特异性酶calpain-3，全球约30%的LGMD患者为此亚型。LGMDR9由FKRP基因的biallelic致病性变异引起，编码糖基化酶fukutin-related protein即FKRP，FKRP功能降低可导致肌细胞膜（sarcolemma）与细胞外基质连接受损从而引起肌肉组织破坏。LGMDR3与SGCA基因的biallelic致病性变异有关，编码蛋白质α-sarcoglycan（SGCA），其与β、γ和δ三种额外sarcoglycan蛋白质结合形成sarcoglycan复合物，为肌营养不良蛋白聚糖（dystroglycan）及抗肌萎缩蛋白（dystrophin）提供连接以进一步支持锚定至肌节和基底膜，SGCA蛋白质缺失会破坏该连接导致肌肉萎缩。目前的腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）介导基因替代允许转移长达4.7 kb的产物，已有6种亚型的临床前或临床试验在进行，但这些疗法的成功可能被视为用足够蛋白质表达替换基因以实现正常肌细胞膜功能，然而由于缺乏临床前模型中明确的功能终点，难以在这些临床试验中代理足够蛋白质表达，而量化杂合子LGMD携带者的蛋白质表达可能对此有所帮助。LGMD携带者定义为在与隐性遗传相关的LGMD基因中具有1个致病或可能致病变异的个体，其不发展为LGMD症状并维持未受影响的骨骼肌功能。研究人员使用LGMD的单倍体充足携带者定义维持正常肌细胞膜功能所需的足够蛋白质表达，将这些携带者与3种常染色体隐性LGMD亚型中的匹配LGMD个体进行比较，假设这些水平可被视为治疗疗效阈值，即AAV基因替代疗法可恢复受影响基因的完全功能及随后的肌肉功能，此外这些数据可支持将蛋白质恢复水平作为基因或蛋白质替代疗法加速批准的替代终点的概念。该研究论文发表在《Neurology Genetics》。
为开展研究用到的主要关键技术方法包括：通过正在进行的自然史研究纳入诊断为LGMDR1、LGMDR3或LGMDR9且经确认在CAPN3、FKRP或SGCA中具有biallelic致病或可能致病变异的个体，收集携带者及成人对照的肌肉活检及血液或唾液样本于内部生物库；使用定制Illumina Ampliseq面板靶向CAPN3、FKRP和SGCA中已知致病变异进行基因分型，并在Illumina iSeq上测序及Sanger测序确认；从肌肉活检中提取RNA并进行总RNA测序（RNA-seq），使用STAR 2.7.11比对至GRCh38，利用DESeq2进行主成分分析（PCA）、差异基因表达分析及标准化计数定量，使用基因组分析工具包（GATK）ASEReadCounter及phASER包量化等位基因特异性表达（ASE）；通过蛋白质印迹法（western blotting）测定疾病相关蛋白质相对定量，使用Image Lab软件进行相对蛋白质定量并将目标蛋白质表达水平归一化至无染色蛋白质表达后与健康对照比较；对LGMDR9样本进行层粘连蛋白覆盖测定（laminin-overlay assay）以评估matriglycan表达及层粘连蛋白结合能力；使用Graphpad Prism version 10进行统计分析，对LGMDR1和R3分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）确定各组统计学显著性。
研究结果部分保留原文小标题并说明结论如下：
Subject Summary，结果显示LGMDR1分析包括6名携带者和5名患病个体，所有携带者含移码变异，患者中9个等位基因为移码1个为错义，多数含c.550delA斯拉夫创始变异且携带者因亲子相关性与患者基因型匹配；LGMDR9分析包括4名携带者和6名患病个体，多为错义变异，1名携带者及1名患者含无义或移码变异，常见p.Leu276Ile北欧创始错义变异，队列以女性为主占70%；LGMDR3分析包括5名携带者和3名患病个体，多为错义变异，3个为移码或无义，无主导创始变异且雌雄各半占50%。
LGMDR1 Carriers Have Intermediate Levels of CAPN3 Gene Expression，研究人员通过差异基因表达热图及RNA-seq标准化计数发现，携带者在顶级差异基因表达（DEGs）上模拟对照且携带者与对照间差异基因数量相对较少，携带者CAPN3标准化计数平均较对照减少约50%但约为患病样本的两倍；通过等位基因特异性表达（ASE）分析发现除1名外其余LGMDR1携带者移码等位基因平均仅表达14.6%的替代单倍型，符合突变等位基因无义介导衰减的预测。
Total Calpain-3 Is Significantly Reduced in Carriers of LGMDR1，研究人员通过3次免疫印迹技术重复检测calpain-3，发现LGMDR1携带者平均总calpain-3表达约为对照的25%（范围16.5%至35%），显著低于杂合携带者预期的50%蛋白质表达，但显著高于LGMDR1患病样本（平均约对照的7.2%，范围3至14.2%）；患病样本中存在约50 kDa的持续残留条带，推测为非特异性检测或calpain-2的C端片段，表明尽管LGMDR1携带者总calpain-3严重减少，仍可维持单倍体充足性。
LGMDR9 Carrier Samples Exhibit FKRP Gene/Protein Expression Similar to Controls，研究人员通过全局基因表达热图、PCA及RNA-seq发现LGMDR9携带者聚类接近对照，FKRP标准化计数在对照、携带者和患病者中大致相当，携带者中等位基因特异性表达略偏向替代等位基因，3名错义携带者平均表达70%致病等位基因，1名无义携带者表达40%致病等位基因提示无义介导衰减；蛋白质印迹显示LGMDR9携带者FKRP蛋白质水平最低但与对照无显著差异，患病个体总FKRP增加3倍，可能为FKRP功能降低的代偿效应。
LGMDR9 Carrier Samples Have Reduced Glycosylated α-Dystroglycan，研究人员使用核心dystroglycan抗体（AF6868）量化α-dystroglycan水平，发现150 kDa代表结合matriglycan的高分子量α-DG，100 kDa为未结合；携带者平均150 kDa α-DG表达为对照的54%，患病个体接近0%；携带者总α-DG（100和150 kDa产物）表达为对照的56%且降低但不显著，患病样本约80%；β-DG表达在携带者和患病样本中分别为对照的46%和73%；患病个体显示显著的100 kDa条带表明α-DG主要为未糖基化，携带者matriglycan结合能力降低。
LGMDR9 Carriers Have ～ 50% FKRP Enzymatic Functionality，研究人员通过IIH6抗体量化matriglycan相对表达及层粘连蛋白覆盖测定评估matriglycan层粘连蛋白结合能力，发现携带者matriglycan表达趋势约为对照的50%，层粘连蛋白结合能力为57.5%即约50% FKRP酶功能，LGMDR9个体几乎无matriglycan和层粘连蛋白表达；表明单倍体充足性在约50% FKRP功能时达到。
Carriers of LGMR3 Have Normal Levels of SGCA Gene Expression，研究人员通过RNA-seq及差异基因表达分析发现LGMDR3携带者与对照在全球基因表达上密切关联，SGCA标准化计数与对照一致而患病个体减少60%；等位基因特异性表达显示错义变异携带者约45%为致病等位基因读取，1名无义变异携带者仅14%提示降解；结果与其他含LGMDR3错义突变样本的RNA-seq研究一致。
LGMDR3 Carriers Have Equivalent α-Sarcoglycan Expression Compared with Controls，研究人员通过4次免疫印迹技术重复发现LGMDR3携带者平均α-sarcoglycan表达为对照的89%（范围77%至103%），患病个体平均9%（范围5.4%至15.1%）；同时评估β-sarcoglycan（SGCB）发现携带者平均SGCB表达为对照的103%（范围82.5%至125%），患病个体平均18.6%（范围16.7%至21.5%），表明SGCB表达与SGCA对应；LGMDR3携带者SGCA蛋白质表达与对照一致。
讨论部分总结及研究结论翻译如下：
讨论部分指出，常染色体隐性LGMD的单倍体充足携带者虽表型与未受影响的对照相当，但在蛋白质表达和功能上常存在差异；LGMDR1携带者约有25% calpain-3蛋白质表达，LGMDR3携带者维持与对照相当的α-sarcoglycan水平，LGMDR9携带者FKRP蛋白质水平与对照相似但酶功能约50%，功能降低呈剂量依赖性介于对照与患病样本之间，表明对某些LGMD亚型，达到50%或更少蛋白质表达的AAV基因替代疗法可实现单倍体充足性。目前ClinicalTrials.gov上有5项活跃LGMD基因替代临床试验，分子结局测量包括蛋白质恢复，但尚未建立足够恢复的阈值；使用非携带者对照作为恢复标准可能高估所需治疗水平，而本分析显示数种LGMD亚型杂合携带者蛋白质恢复降低但仍维持健康表型，提供了单倍体充足个体的相对蛋白质表达和功能范围，提示降低野生型蛋白质恢复标准可作为治疗成功的基准。LGMDR1（CAPN3）携带者均为null变异杂合子，预期calpain-3减少50%但实际约25%，可能因calpain-3可形成催化同源三聚体，二聚化增强酶活性从而减少肌肉维持所需量，且总RNA-seq显示calpain-3水平降低未改变全局基因表达，降低了基因替代治疗功效的障碍。LGMDR9（FKRP）队列多为错义变异，FKRP蛋白质表达和功能观察与既往小鼠模型研究不同，本研究发现携带者FKRP蛋白质正常、患病者急剧增加可能为代偿机制，携带者IIH6检测的matriglycan约50%减少，层粘连蛋白覆盖测定佐证，α-DG表达轻微降低提示肌细胞膜恶化，中间水平的α-DG和matriglycan定义了单倍体充足性可为LGMDR9基因替代疗法结局测量提供信息。LGMDR3（SGCA）携带者SGCA蛋白质水平与对照相当且显著高于患病者，SGCB镜像SGCA表达，约50% SGCA转录本来自致病等位基因但因内质网相关降解（endoplasmic reticulum-associated degradation, ERAD）降解突变sarcoglycan蛋白质，膜上无法组装的也会降解，故携带者样品中提取的蛋白质为功能性α-sarcoglycan，表明LGMDR3携带者并非单倍体充足而是维持与对照一致的功能性α-sarcoglycan水平。本研究首次检查LGMD携带者蛋白质表达，既往研究量化了患病个体蛋白质表达可提供比较；LGMDR1既往分析显示calpain-3表达依赖基因型，纯合移码突变者完全丢失而复合杂合含1个错义者有正常表达，与本分析一致即至少含1个null等位基因的个体均减少calpain-3；LGMDR9分析与文献未收敛，既往层粘连蛋白覆盖分析显示约10%患病者matriglycan与对照相等，与本研究中接近0%不同，可能因实验参数或混杂因素；LGMDR3既往SGCA-null小鼠模型显示杂合子α-sarcoglycan与野生型一致，与本研究结果相符。本研究存在局限性包括携带者基因型范围广影响蛋白质水平和功能、样本量小、肌肉活检质量限制分子功能测定。FDA的生物制品评价与研究中心（Center for Biologics Evaluation and Research, CBER）考虑LGMD基因疗法申请加速批准并指出蛋白质定量是有效生物标志物，本研究发现的单倍体充足蛋白质阈值可提供恢复标准以支持加速批准，降低某些LGMD亚型基因治疗剂量以匹配单倍体充足携带者可减少成本、降低病毒载体不良免疫反应和毒性风险，降低恢复门槛可使这些改变生活的疗法在可预见未来获得批准。
研究结论翻译为：在此，研究人员证明虽然常染色体隐性LGMD的单倍体充足携带者的表型与未受影响的对照相当，但携带者在蛋白质表达和功能上往往存在差异。LGMDR1携带者约有25%的calpain-3蛋白质表达，而LGMDR3携带者维持与对照相当的α-sarcoglycan水平。LGMDR9携带者的FKRP蛋白质水平与对照相似，但表现出约50%的酶功能。在LGMDR9的情况下，功能降低呈剂量依赖性，介于对照和患病样本之间。这些发现表明，对于某些LGMD亚型，达到50%或更少蛋白质表达的AAV基因替代疗法将导致单倍体充足性。
