从角膜缘、结膜和口腔黏膜活组织检查获得的祖细胞在硅水凝胶接触镜上培养共享CD90、CK15、nestin、CXCR4和SDF-1生态位标志物但保留组织特异性特征和分化方向

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Progenitor cells from limbal, conjunctival and oral mucosal biopsies cultivated on silicone hydrogel contact lenses share CD90, CK15, nestin, CXCR4 and SDF-1 niche markers but preserve tissue-specific characteristics and differentiation directions

　　

背景：角膜缘、结膜或口腔黏膜（OM）上皮外植体培养用于治疗角膜缘上皮干细胞缺乏症（LSCD），但其特征仍不明确。方法：研究人员在硅水凝胶接触镜上建立外植体培养，并对来源组织样本进行免疫荧光显微镜检查，检测角膜缘上皮祖细胞、角膜分化和假定角膜缘生态位标志物。使用全玻片共聚焦图像进行定量分析。结果：在所有来源组织样本中，观察到了大量p63⁺和一些vimentin⁺基底上皮细胞，以及CD90⁺基质细胞。所有上皮均表达CXCR4。SDF-1主要在角膜缘和结膜的上皮中，在基质中仅弱表达，而在OM中则局限于基质。在所有外植体培养中，vimentin⁺/p63α⁺小细胞丰富。对于角膜缘外植体，其比例在来源处最高（68%），并随距离显著下降，表明其具有最高的再生和分化潜能。OM显示最低比例（38%），且随距离无变化，而结膜外植体处于中间范围。角膜型CK3⁺和分化程度较低的CK19⁺上皮细胞密度在角膜缘和结膜样本中随距来源距离增加而增加（R²:0.3-0.44，p≤0.05），但在OM中没有变化（R²<0.02，p>0.47）。除了来源特异性角蛋白模式的主导外，成熟分层上皮的所有CK均可检测到，而CK14和CK15证实了较不成熟上皮细胞的存在。空间成熟梯度仅对角膜缘来源具有特征性。一些CD90⁺假定生态位细胞，被CK15⁺和nestin⁺细胞包围，在所有样本中形成明显的簇。SDF-1和CXCR4存在于所有培养物中，其分布模式与来源组织相似。结论：尽管存在相似性，包括假定的生态位相关细胞簇，在硅水凝胶表面上来自三种上皮的外植体培养仍保持其原始来源的特征。其SDF-1和CXCR4含量表明具有与宿主角膜缘生态位建立接触的能力，这可能是移植后长期存活和位点特异性分化的先决条件。角膜缘外植体显示出最高的增殖和分化潜能，而从结膜和OM来源产生角膜上皮样细胞的效率逐渐降低。

论文解读文章

**研究背景与存在问题**
角膜上皮干细胞位于角膜缘区域，其微环境（角膜缘生态位）由角膜缘成纤维细胞、黑素细胞及特定生长因子、细胞因子和细胞外基质分子构成，维持干细胞的静止与增殖。当角膜缘上皮干细胞（LESCs）受损时，角膜表面会形成非透明且血管化的上皮，导致疼痛且视力丧失的疾病，即角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）。为治疗该疾病，临床上常从对侧眼（单侧病例）或同种异体供体眼/其他自体来源（双侧病例）移植上皮细胞。口腔黏膜（OM）上皮和结膜上皮是两种常用的自体替代来源。外植体培养是一种相对简单的细胞扩增技术，将含上皮和上皮下结缔组织的小活检样本置于载体表面，细胞在培养基中生长。这种培养方法无需小鼠成纤维细胞（3T3）饲养层，降低了免疫反应和动物病毒传播风险。然而，外植体培养的细胞组成及其对角膜缘、结膜或口腔黏膜来源的依赖性尚不清楚。此外，外植体培养是否包含能与宿主生态位接触并补充宿主生态位的生态位元素，仍是未解问题。本研究旨在比较来自这三种组织的外植体培养的扩增和分化特征、假定生态位细胞和干细胞的存在，以及可能参与移植过程中上皮-生态位相互作用的因素。

**研究内容与结论**
研究人员从人类角膜缘、结膜穹窿部和口腔黏膜活检样本中建立外植体培养，以Lotrafilcon A接触镜作为载体。通过共聚焦和全玻片免疫荧光显微镜，对来源组织及细胞外生长的全标本进行定量和定性分析，以表征外植体生长中的细胞类型。研究发现，三种上皮来源的外植体培养均包含大量高度未成熟细胞，表现出上皮和间充质/生态位来源的特征，并显示出不同程度的组织特异性及角膜上皮分化潜能。在所有培养物中，CD90⁺/CK15⁺/nestin⁺细胞簇形成类似生态位结构的区域。此外，SDF-1和CXCR4阳性细胞可能具有与宿主角膜缘生态位建立接触的能力。角膜缘外植体表现出最高的增殖和分化潜能，结膜次之，口腔黏膜最低。该研究发表在国际期刊《Frontiers in Cell and Developmental Biology》上，意义在于揭示了外植体培养中生态位相关细胞的存在，并为优化LSCD治疗策略提供了理论基础，特别是通过SDF-1/CXCR4信号轴增强生态位-上皮相互作用。

**主要技术方法**
研究人员使用了以下关键技术方法：从8名供体（15个角膜缘、12个结膜、5个口腔黏膜样本）获取组织，部分用于冷冻切片免疫组化，部分用于外植体培养。将2 mm大小活检样本缝合至Lotrafilcon A接触镜（Air Optix Night and Day Aqua, Alcon）象限上，在含10%胎牛血清、10 μg/ml胰岛素、10 ng/ml EGF和0.5 μg/ml氢化可的松及抗生素的DMEM:F-12培养基中培养2-3周。培养结束后，固定细胞外生长并进行免疫荧光染色，使用一抗混合物（包括抗ΔNp63α/TAp63α、抗CXCR4、抗SDF-1、抗CK3、抗CK4、抗CK12、抗CK13、抗CK14、抗CK15、抗CK19、抗vimentin、抗CD90、抗nestin）和二抗，通过Pannoramic Confocal数字病理扫描仪和Zeiss LSM 880共聚焦激光扫描显微镜进行成像。定量分析使用ImageJ和QuPath软件，在1 mm方形区域中计数阳性细胞，并测量距外植体来源的距离。统计采用单因素或双因素方差分析及线性回归。

**研究结果**
**组织来源中的标志物表达**
在组织切片中，角膜上皮上层表达CK3和CK12，基底层表达CK14。角膜缘上皮表达CK3、CK12、CK13、CK4、CK14和CK19。结膜上皮表达CK19、CK13、CK14，并弱表达CK3。OM上皮表达CK13、CK4、CK14、CK19，部分细胞也表达CK3。所有组织的基底上皮层均含有vimentin阳性细胞，其位于p63强阳性基底上皮细胞附近。在结膜和角膜缘，vimentin阳性细胞存在于基底上皮层；在OM中，则主要位于基质侧。
**SDF-1和CXCR4表达**
所有三种组织中均存在SDF-1和CXCR4。在结膜和角膜缘，上皮细胞中SDF-1和CXCR4染色强阳性，基质细胞中SDF-1弱阳性。而在OM中，SDF-1仅存在于基质细胞，CXCR4则在上皮细胞中。
**CD90阳性假定生态位细胞**
CD90⁺假定生态位相关基质细胞存在于角膜缘、结膜和OM样本的上皮下基质中。在角膜缘和结膜中，这些细胞稀少且分散；在OM中，它们在上皮内基质突起中形成丰富簇。
**外植体培养中的细胞组成**
所有三种组织来源的接触镜表面培养细胞层均包含许多小的vimentin阳性细胞，伴有p63α核染色。结膜来源中许多vimentin⁺细胞呈长梭形成纤维细胞样，而OM和角膜缘样本以小的圆形细胞为主。定量分析显示，角膜缘外植体在近来源处产生最大比例（68%±13%）的未分化vimentin⁺/p63⁺细胞，且随距离显著减少，表明其具有最高的增殖和分化能力。结膜样本中比例为52%±0.04%，但无显著变化；OM比例最低（35%±0.06%），且无下降趋势。
**角蛋白表达模式**
培养细胞中除了组织特异性角蛋白模式外，还检测到成熟分层上皮的所有角蛋白，包括角膜特异性CK3（在结膜和OM外植体中也存在），以及CK14和CK15（较未成熟上皮细胞标志物）。定量分析显示，角膜缘来源的CK19⁺和CK3⁺细胞密度显著高于OM。在角膜缘和结膜样本中，CK3⁺和CK19⁺细胞数量随距来源距离增加而增加，而OM无此相关性。在分化细胞中，角膜缘样本以CK3⁺细胞为主，结膜样本以CK19⁺细胞为主，结膜和OM样本中CK13⁺细胞更普遍。角膜缘样本中观察到从基底CK14⁺细胞向CK19⁺和CK3⁺细胞的定向迁移，类似于天然角膜缘组织的分层结构；该模式在结膜细胞层中较不明显，在OM中完全不可见。
**生态位样结构**
所有三种组织来源的培养物中，一些小的vimentin⁺细胞为CD90⁺，并形成由nestin⁺和CK15⁺细胞包围的区域，类似于生态位结构。CD90⁺细胞在角膜缘和结膜培养中呈单个细胞组，而在OM中形成簇，与组织来源中的模式相似。这些CD90⁺组位于近来源或中距离处。
**SDF-1和CXCR4表达**
SDF-1和CXCR4阳性细胞存在于所有三种培养细胞层中。在角膜缘和结膜样本中，小的圆形细胞多为SDF-1⁺，同时存在较大的CXCR4/SDF-1双阳性细胞。在OM中，双阳性细胞稀少，与组织样本相似。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次在角膜缘、结膜和OM外植体培养中观察到CD90⁺基质细胞群体，并与nestin⁺和CK15⁺细胞形成空间关联，提示可能具有生态位支持功能，但尚需功能研究证实。SDF-1/CXCR4信号轴在角膜缘生态位-上皮连接中起关键作用，其在外植体培养中的存在表明移植后有可能与宿主生态位重新建立相互作用。研究还发现，角膜缘外植体具有最高的再生和分化潜能，而结膜和OM来源产生角膜上皮样细胞的效率逐渐降低。Lotrafilcon A接触镜为外植体培养提供了优良表面，维持了大量未成熟细胞和部分生态位特征。
研究结论为：尽管存在相似性，包括假定的生态位相关细胞簇，在硅水凝胶表面上来自三种上皮的外植体培养仍保持其原始来源的特征。其SDF-1和CXCR4含量表明具有与宿主角膜缘生态位建立接触的能力，这可能是移植后长期存活和位点特异性分化的先决条件。角膜缘外植体显示出最高的增殖和分化潜能，而从结膜和OM来源产生角膜上皮样细胞的效率逐渐降低。