《International Journal of Pharmaceutics》：From charge shifting to membrane engagement: next-generation cubosomes for enhanced intracellular drug delivery
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研究人员设计了肠碱性磷酸酶（IAP）响应的cubosome，其在上皮界面改变表面电荷以增强细胞接合，同时解决聚阳离子困境。首先，研究人员用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）对cubosome进行阳离子化，制备未包被的阳离子cubosome（UC），然后用三聚磷酸
研究人员设计了肠碱性磷酸酶（IAP）响应的cubosome，其在上皮界面改变表面电荷以增强细胞接合，同时解决聚阳离子困境。首先，研究人员用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）对cubosome进行阳离子化，制备未包被的阳离子cubosome（UC），然后用三聚磷酸盐（TPP）包被，生成阴离子制剂，称为TPP包被的cubosome（TC）。IAP响应性的zeta电位反转TPP包被cubosome，并实现了磷酸酶触发的去磷酸化，通过可测量的磷酸盐释放得以证实。包被的cubosome在某些生理相关介质中保持稳定，并显示出比未包被cubosome更好的生物相容性。在Caco-2和HEK293细胞中，通过网格蛋白途径在37°C（能量依赖）和4°C（能量非依赖）下验证了特异性膜接合。
**论文解读：下一代cubosome——从电荷转换到膜接合以增强细胞内药物递送**
**1. 研究背景与问题**
纳米粒子（NPs）因其独特的理化特性在纳米医学领域占据前沿地位，尤其在可控药物释放、增强成像能力及新型免疫诊断策略方面展现出巨大潜力。其中，脂质纳米粒子因固有的生物相容性、结构多样性和包载亲水/疏水药物的能力而备受关注。在众多脂质纳米粒子架构中，反相双连续立方液晶相纳米分散体（cubosome）作为先进药物递送应用的纳米载体（NCs）引起了广泛关注。Cubosome由两亲性脂质自组装形成双连续立方相，构成一个沿无限周期极小曲面（IPMS）折叠的脂质双层，产生两个不相交的水通道的三维网络。与传统的层状脂质体相比，这些非层状纳米粒子由于增大的内部疏水体积，能提供更高的胶体稳定性和载药量，尤其适用于疏水性药物。
然而，吸收位点的细胞膜呈聚阴离子特性，因此阳离子载体可通过静电吸引促进摄取。但提升细胞摄取不可避免地会降低血液相容性，因为阳离子载体与阴离子红细胞和血清蛋白的强静电相互作用会驱动吸附、聚集和溶血，构成所谓的“聚阳离子困境”。为解决这一困境，一个有效策略是开发能够实现电荷反转的酶响应性纳米载体。位于细胞膜上的肠碱性磷酸酶（IAP）能快速高效地裂解纳米载体上的磷酸盐亚结构，这为设计带初始负电荷、在靶细胞处被IAP转化为正电荷的纳米载体提供了理想途径。尽管功能纳米载体研究日益增多，但具有电荷转换能力的cubosome此前尚未见报道。
**2. 研究目的与内容**
为解决上述问题，研究人员开发了一种具有可调表面电荷特性的cubosome。该研究旨在通过IAP响应性电荷转换机制，在增强细胞摄取的同时规避阳离子载体的全身毒性，解决“聚阳离子困境”。研究论文发表在《International Journal of Pharmaceutics》。
**3. 主要关键技术方法**
1. **水溶助剂辅助法制备cubosome**：采用甘油单油酸酯（GMO）和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）通过水溶助剂辅助法制备阳离子cubosome（UC）。
2. **表面包被技术**：通过静电络合作用，用三聚磷酸盐（TPP）对阳离子cubosome进行表面包被，形成阴离子制剂（TC）。
3. **酶触发响应性评估**：利用碱性磷酸酶（IAP）研究TC的zeta电位变化和磷酸盐释放，以验证其电荷转换行为。
4. **细胞摄取机制研究**：使用氯丙嗪（CPZ）作为网格蛋白介导内吞（CME）的抑制剂，结合流式细胞术，在37°C（能量依赖）和4°C（能量非依赖）条件下，分析Caco-2（人结直肠腺癌细胞）和HEK293（人胚肾细胞）细胞对cubosome的摄取途径。
**4. 研究结果**
**4.1. 制剂与理化表征**
通过透射电镜（TEM）观察到UC和TC均为球形，且内部立方晶格结构完整。zeta电位从UC的+18.03 mV剂量依赖性降至TC的-19.07 mV，证实TPP成功包被。包被后粒径保持在约150-160 nm，多分散性指数（PDI）低，表明制剂分散均匀。最终选择300 μL TPP的配方（zeta电位约-14.3 mV）进行后续研究，因其能有效实现酶诱导的电荷转换。
**4.2. 稳定性**
在模拟生理介质（HBS、HEPES、FeSSIF、FaSSIF、FaSSGF）中，UC和TC的粒径均保持在约150-160 nm。但TC的PDI在所有介质中均维持低且稳定，而UC的PDI较高，尤其在FeSSIF和FaSSGF中，表明TC具有更好的胶体稳定性。
**4.3. 膜相互作用（血液相容性）**
溶血实验显示，在0.1% (w/v)浓度下，UC引起71.97%的溶血，而TC仅引起17.89%。在0.05%浓度下，该差异更为显著（42.33% vs 6.36%）。这证实了TPP包被在提高血液相容性方面的关键作用，有效缓解了“聚阳离子困境”。
**4.4. 细胞活力**
通过刃天青还原实验评估细胞毒性。在HEK293和Caco-2细胞中，TC在所有测试浓度下均表现出比UC更低的细胞毒性。在HEK293细胞中，TC在所有浓度下均维持≥80%的细胞活力，而UC在高浓度（0.1%和0.05%）时使活力降至40%以下。在Caco-2细胞中，TC在0.1%浓度下仍保持约70%的活力，显著优于UC（<40%）。这表明表面包被有效减轻了剂量依赖性的细胞毒性。
**4.5. 磷酸裂解与细胞摄取**
**4.5.1. 表面电荷转换与IAP触发的磷酸盐释放**
在有IAP存在时，TC的zeta电位在24小时内从-14.30 mV逐渐升高至-0.79 mV，同时伴随快速的磷酸盐释放（<1小时）并达到约300-340 μM，而无酶对照组磷酸盐释放量≤80 μM。这证实了IAP介导的TPP去磷酸化是实现电荷反转的机制。
**4.5.1.1. 在Caco-2和HEK293细胞中的磷酸盐释放**
在Caco-2细胞（高IAP表达）和HEK293细胞（低IAP表达）中，TC在无磷酸酶抑制剂（PIC2）条件下均释放出更多磷酸盐，而PIC2预处理组显著抑制了磷酸盐释放。这证实了细胞膜相关磷酸酶是驱动去磷酸化的关键因素。
**4.6. 体外细胞摄取**
流式细胞术结果显示，在Caco-2细胞中，TC组的相对平均荧光强度（RMFI）显著高于HBS和游离荧光染料（FDL）对照组。加入PIC2后，TC的RMFI骤降至基线水平，表明磷酸酶活性是TC实现高效细胞结合所必需的。在HEK293细胞中观察到相同模式，证明该效应是跨细胞系的通用界面机制。
**4.7. 转运机制**
**4.7.0.1. 网格蛋白介导的细胞摄取**
在37°C下，Caco-2细胞中，CPZ预处理显著降低了TC和UC的摄取，表明网格蛋白介导的内吞（CME）是其主要摄取途径之一。而在HEK293细胞中，CPZ对TC和UC的摄取无显著影响，表明其摄取主要依赖网格蛋白非依赖性转运机制。这体现了细胞类型对摄取途径的影响。
**4.7.0.2. 能量依赖的细胞摄取**
在4°C（抑制能量依赖的内吞）下，TC和UC在Caco-2和HEK293细胞中仍显示出显著的荧光信号，且CPZ对其影响不大。这表明，除了能量依赖的内吞途径，还存在能量非依赖的摄取机制，例如cubosome与细胞膜的融合过程，从而在低温下仍能实现有效的膜接合。
**5. 讨论与结论**
**讨论总结：** 该研究成功开发了一种新型TPP包被的IAP响应性cubosome（TC），有效解决了“聚阳离子困境”。TC在生理相关介质中表现出优异的胶体稳定性、低溶血性和低细胞毒性，安全窗口明确。酶触发实验证实，TC可通过IAP介导的TPP去磷酸化实现从负到正的表面电荷转换，从而促进细胞摄取。摄取机制研究表明，TC的摄取是复杂的，涉及网格蛋白介导的内吞和能量非依赖的膜融合等多种途径，具体途径取决于细胞类型。该研究为设计更安全、更高效的下一代脂质纳米载体提供了新策略。
**研究结论：** TPP包被的cubosome（TC）在各项评估中均优于未包被的对照（UC）。TC保持了约150-160 nm的粒径，实现了更窄的分散度（低且稳定的PDI）和可调节的负zeta电位。在生物相关介质中，TC维持了胶体完整性，而UC的PDI变宽，表明其更易聚集。表面包被显著降低了所有测试剂量下的溶血率，并在HEK293和Caco-2细胞中维持了高细胞活力，为TC定义了明确的生物相容性窗口。在表达碱性磷酸酶的缓冲液和细胞中，TC显示出时间分辨的磷酸盐释放和zeta电位恢复，且两种读数均被PIC2抑制，证实了磷酸酶依赖的表面电荷转换。流式细胞术结果与上述效应一致：TC相较于载体和游离染料产生了显著的荧光右移和RMFI增益，而该优势在加入PIC2后消失。温度分辨实验表明，TC在37°C和4°C条件下均实现了更优的细胞结合，尤其在4°C抑制能量依赖性内吞后，T
C仍产生大量且对CPZ不敏感的荧光信号，表明其摄取机制涉及能量非依赖途径。综上所述，这些结果确立了TPP包被的cubosome作为一种胶体稳定、更安全且摄取效率更高的载体，其中300 μL TPP配方是用于后续转化研究的首选制剂。
