《JID Innovations》：AI based quantification of epidermal proliferation and apoptosis in human skin
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尽管人工智能（AI）正在迅速发展，但其在转化皮肤病学研究中的应用仍然有限。在本研究中，研究人员建立了一种基于AI的图像分析工作流程，利用基于二氨基联苯胺（DAB）的免疫组织化学（IHC）染色对人体表皮内的增殖和凋亡进行量化。研究人员利用石蜡包埋和Ki-67及裂
尽管人工智能（AI）正在迅速发展，但其在转化皮肤病学研究中的应用仍然有限。在本研究中，研究人员建立了一种基于AI的图像分析工作流程，利用基于二氨基联苯胺（DAB）的免疫组织化学（IHC）染色对人体表皮内的增殖和凋亡进行量化。研究人员利用石蜡包埋和Ki-67及裂解半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3, CASP3）的IHC染色处理在3D体内模型中培养的人体皮肤。研究人员实施了一种基于AI的双模型工作流程：一个用于细胞检测的定制训练卷积神经网络（Convolutional Neural Network, CNN）模型，以及一个专门分离表皮的语义分割（semantic-segmentation）模型。通过结合两个模型，研究人员将细胞注释和分类限制在感兴趣的表皮结构内，实现了全切片图像（Whole-Slide Images, WSIs）上的表皮受限量化。针对手动计数的验证显示，两种标志物在不同染色批次和时间点上均具有高一致性（Ki-67平均准确度95.43%；CASP3 97.0%）。为测试工作流程的实验适用性，研究人员在绒毛尿囊膜（Chorioallantoic Membrane, CAM）上培养的人体皮肤中应用羟基酪醇（Hydroxytyrosol, HT）。该基于AI的工作流程最小化了主观偏差并提供了连贯的读数，显示HT处理的样本增殖减少而未诱导凋亡反应。总体而言，该工作流程以适度的训练工作和注释实现了强劲性能，提供了一种支持转化皮肤病学研究并具有皮肤病理学应用潜力的可扩展方法。
研究背景与意义
在组织病理学与转化皮肤病学研究中，传统的组织学标本评估依赖专家显微镜目视检查，这一过程耗时且易受主观解释影响，随着组织研究规模和复杂性的增加构成了重大挑战。尽管数字病理学与全切片图像（Whole-Slide Images, WSIs）使得组织切片的高分辨率数字化成为可能，但组织数据的海量与异质性仍需稳健的计算方法。虽然人工智能（Artificial Intelligence, AI）特别是卷积神经网络（Convolutional Neural Networks, CNNs）在胃肠肿瘤及乳腺癌分类等诊断流程中提升了准确性与效率，但在皮肤病理学（dermatopathology）与皮肤组织学中的应用仍较为有限。皮肤作为人体最大器官，其诸多病理状况以表皮稳态失调为特征，表现为角质形成细胞增殖与凋亡速率的改变，常需借助Ki-67（增殖标志物）与裂解半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3, CASP3，凋亡级联重要分子）进行免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）评估。然而，目前缺乏针对皮肤IHC的自动化、客观量化工具。因此，研究人员开展此项研究，旨在建立基于AI的表皮受限量化工作流程，以解决主观偏差并提升转化研究的 scalability（可扩展性）。该研究发表于《JID Innovations》。
主要关键技术方法
研究人员采用来自女性整形外科手术的人类皮肤样本（经伦理委员会批准及知情同意），在绒毛尿囊膜（Chorioallantoic Membrane, CAM）3D体内模型中进行培养与处理。组织经石蜡包埋后行Ki-67与CASP3的IHC染色（DAB显色）及苏木精复染，使用PreciPoint M8扫描仪获取40倍WSIs。分析基于IKOSA平台构建双模型AI流程：其一为定制训练的CNN细胞检测模型（初训纳入人胰腺组织以预适应核形态，再微调于人皮肤），其二为表皮语义分割模型。通过融合两模型输出实现仅限表皮区域的细胞计数与分类（表皮受限量化），并以手动计数、不同时间点批次及阴性对照验证准确性与鲁棒性，应用实例为局部羟基酪醇（Hydroxytyrosol, HT）处理效应评估。
研究结果
AI cell-detection model
研究人员训练的CNN细胞检测模型在定性可视化中对Ki-67阳性与阴性细胞表现出高可信度注释，且在无特异性免疫染色的阴性对照中未将黑色素等背景特征误注，显示特异性。然而初期定量验证因手动标注仅限表皮而模型计数含真皮全域，导致阳性类别精确度（Precision）仅38.71%、召回率（Recall）28.57%，未达预设目标，提示需限制分析区域。
AI epidermis-recognition model
研究人员训练了专用语义分割模型以识别表皮（排除角质层）。在独立16个感兴趣区（Regions Of Interest, ROIs）验证中，该模型达Dice系数0.96，像素精确度94.95%，召回率96.23%，特异性98.59%，且能抵抗苏木精强度差异等染色变异，准确勾勒表皮边界。
Combined workflow: AI-based epidermis-constrained quantification
Manual validation
结合细胞检测与表皮识别模型后，研究人员在阳性细胞比率层面验证，Ki-67自动与手动计数中位绝对差（Median Absolute Difference, MAD）为0.42百分比点（percentage points, pp），平均准确度95.43%；CASP3平均准确度达97.0%，相对增量（Relative delta）为负或近零，表明算法假阳性偏倚低。
Day-to-day variability
研究人员对同一批样本在不同时间点（批次）染色分析，发现两批次间阳性比率差异均值仅0.19 pp，虽存在细微解剖切面异质性，但整体日际变异极小，流程稳定。
Control-Slide Verification
在10张阴性对照WSIs（32,711个细胞）中，模型仅赋予29个细胞“阳性”标签，片级均值0.08%±0.06标准差（Standard Deviation, SD），Tris/EDTA与柠檬酸盐抗原修复间无差异，证实 spurious positivity（伪阳性）可忽略。
Application to apoptosis quantification
因CASP3与Ki-67同为核DAB信号且形态相似，研究人员复用Ki-67训练的细胞检测模型于CASP3无需重训。验证显示自动与手动阳性比率几乎一致（MAD 0.04 pp），证明双标志物评估可行性及模型在相似染色形态下的迁移能力。
HT reduces proliferation in epidermal cells
研究人员将流程应用于CAM模型上HT处理的人皮肤样本（N=3，处理1天与6天）。量化显示6天HT处理显著降低了表皮Ki-67阳性细胞比例（t检验 p=0.016），而CASP3阳性细胞比例无显著变化，表明HT在体外人体皮肤中具有抗增殖效应且不诱发凋亡。
讨论与结论总结
研究人员在讨论中指出，本研究在3D体内模型的实际实验环境中建立并部署了基于AI的工作流，通过整合细胞检测与表皮识别模型，实现了客观、可扩展且可重复的表皮增殖与凋亡量化，解决了组织学分析中需高通量、可重复的挑战。该双模型设计通过表皮受限减少了成纤维细胞等真皮细胞干扰及假阳性，提升了样本级指数的可解释性。即便在含黑色素等内源性背景特征的阴性对照中，模型亦未产生人工信号，显示出对皮肤组织常见混淆因子的鲁棒性。此外，该工作流以较少标注量（约5,800个细胞及少于50个表皮注释）达成约95%以上准确度，且Ki-67训练模型可直接迁移至形态相似的CASP3而精度更高（约97%），体现了标注效率与标志物通用潜力。此研究填补了AI在皮肤病学非肿瘤领域IHC分析的空白（PubMed检索极少相关发表）。应用实例中HT显著降低增殖而不增凋亡，提示其对细胞周期动力学或直接通路的调控，与部分文献一致但也存在情境依赖性争议，需进一步转化研究。总体而言，基于IKOSA平台的AI流程以适度标注实现了准确可重复的量化，输出友好，具备整合入临床辅助诊断及皮肤病理转化研究的潜力。
研究结论翻译：在本研究中，研究人员建立并部署了一种基于人工智能（AI）的工作流程，利用3D体内模型对免疫组织化学（IHC）染色的人体皮肤进行定量分析。通过整合用于细胞检测的AI模型与第二个用于表皮识别的AI模型，研究人员实现了对表皮增殖和凋亡的客观、可扩展且可重复的量化。作为应用示例，研究人员使用这种表皮受限的AI工作流程评估了羟基酪醇（HT）处理对人体皮肤的影响。这种方法使研究人员能够解决组织学图像分析中的核心挑战，特别关注了对大型数据集进行客观、高通量和可重复量化的需求。研究人员的主要目标是在实际研究约束下测试训练模型，而非仅在策展基准中测试。实验设置提供了生物学上有意义的变异，包括不同患者、不同分析时间点和真实的染色变异，允许在全幻灯片尺度上进行评估。在这种环境下，两个AI模型结合产生的表皮受限量化最小化了真皮细胞的混淆，减少了假阳性，并提高样本级指数的可解释性。为了评估工作流程的可靠性，研究人员还分析了缺乏特异性免疫染色但含有具有挑战性的内源性背景特征（如黑色素）的玻片，这些特征是明场成像中模拟DAB阳性核的已知混淆因素。阴性对照玻片的代表性叠加图和全幻灯片分析显示，AI模型未将黑色素沉积等背景特征误分类或生成人工信号，强调了针对视觉相似但非特异性信号的鲁棒性。工作流程的一个实际优势是其标注工作量与所实现性能之间的有利平衡。尽管依赖于相对适量的标注，即细胞检测模型约5,800个细胞和表皮识别少于50个标注，模型达到了约95%或更高的准确度、精确度和特异性满意值。此外，在Ki-67上训练的细胞检测模型可直接转移到具有相似DAB染色形态的另一核标志物（CASP3）而无需重新训练，实现了甚至更高的验证准确度（约97%，比Ki-67高约1.5%）。这强调了当染色模式可比时标志物泛化的潜力。虽然此策略使研究人员避免了为本研究中每种抗体开发一个模型，但注意到当靶向染色形态显著不同的抗体时，将需要重新训练。然而，即使在这种情况下，只要表皮仍是感兴趣的结构，我们的双模型设计仍保持训练高效，因为仅细胞检测组件需要重新训练。这项工作代表了将AI在皮肤病学中的应用扩展到肿瘤学领域之外的宝贵贡献。现有皮肤病病理学中大多数基于AI的应用主要集中在标准苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色切片上。相比之下，我们的方法提供了一种分析IHC的可重复方法，能够在同时检测一般组织形态信息（如表皮识别）的情况下评估特定标志物。将工作流程应用于HT处理的样本，观察到处理后六天表皮增殖显著减少，而未伴随凋亡增加。由于抗增殖效应与程序性细胞死亡率增加不相关，这一发现表明对细胞周期动力学或替代途径的直接影响。此外，我们的发现与描述HT在上皮和黑色素瘤系统中生长抑制或细胞周期调节活性的出版物一致。然而，也有研究报道HT对增殖有正向影响。这表明上下文依赖效应，反映了模型系统、炎症状态和剂量的差异。因此，需要进一步研究其在伤口修复中的转化应用。总之，我们发现集成到IKOSA平台中的基于AI的应用以适度的标注努力提供了对IHC染色人体皮肤的准确且可重复的量化。输出格式用户友好且一目了然，促进了直接的下游分析并能够整合到进一步应用中。鉴于该方法在生物学和技术变异性方面的可转移性和鲁棒性，将其整合到作为补充诊断程序的既定临床工作流程中似乎是可行的。捕获生物学连贯的治疗效应的能力表明，表皮受限的AI工作流程可能对皮肤病病理学的研究和转化工作有用且可扩展。
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