细粒棘球绦虫 sensu stricto (Echinococcus granulosus s.s.) 基于线粒体DNA的全球比较系统地理学研究：整合GenBank数据集与阿富汗新表征分离株

《Transboundary and Emerging Diseases》：Global Comparative Phylogeography of E. granulosus s.s. Inferred From Mitochondrial DNA: Integrated Datasets of GenBank and Newly Characterized Isolates From Afghanistan

　　

包虫病（Cystic echinococcosis, CE）由细粒棘球绦虫 sensu stricto (Echinococcus granulosus sensu stricto, E. granulosus s.s.) 引起，仍是具有全球公共卫生重要性的主要人畜共患病。阿富汗被认为是CE流行区；然而，关于循环寄生虫种群的分子数据极其稀缺。本研究旨在将阿富汗的E. granulosus s.s. 纳入综合的全球线粒体数据集中，表征其遗传多样性、种群结构和全球系统地理学关系。研究人员从阿富汗的牲畜宿主（牛、绵羊和山羊）中收集了棘球蚴囊，并对线粒体细胞色素c氧化酶亚基1 (cytochrome c oxidase subunit 1, cox1) 和NADH脱氢酶亚基1 (NADH dehydrogenase subunit 1, nad1) 基因进行测序，并与从GenBank检索到的全面全球数据集一并分析。研究人员采用了遗传多样性指数、中性检验、中位连接（Median-joining, MJ）单倍型（Haplotype, H）网络、滑动窗口分析以及基于串联线粒体序列的系统发育重建。所有阿富汗分离株均被鉴定为E. granulosus s.s.，其中基因型G1占绝对优势，仅有一株G3分离株。阿富汗种群表现出中度至高度的单倍型（H）多样性（Hd），但核苷酸多样性低，表明密切相关的单倍型（Hs）仅由少数突变分隔。全球单倍型（H）网络显示出星形拓扑结构，具有广泛的洲际单倍型（H）共享，且无宿主或地理特异性聚类。系统发育和网络分析证实了全球G1谱系遗传的一致性以及G3的有限多样性。滑动窗口分析显示全基因组中性且不存在局部选择性清除。综上，这些发现将阿富汗E. granulosus s.s. 种群定位在一个全球互联的传播网络中，突出了牲畜流动和历史扩散在塑造当代CE流行病学中的作用。本研究填补了关键的区域知识空白，并为流行区的监测、控制和全健康（One Health）干预措施提供了一个稳健的系统地理学框架。

该研究发表于《Transboundary and Emerging Diseases》。目前细粒棘球蚴病（Cystic echinococcosis, CE）作为被忽视的人畜共患病在全球尤其是 pastoral 和农村环境中造成严重社会经济负担，由细粒棘球绦虫 sensu lato (E. granulosus s.l.) 物种复合体中的细粒棘球绦虫 sensu stricto (E. granulosus s.s.) 主要引发，其中基因型 G1 和 G3 是全球人类 CE 的主要致病原。现有分子数据存在地理偏差，多集中于欧洲、东亚和中东部分地区，中亚和西亚存在显著空白，而阿富汗作为关键但未被充分探索的流行区，缺乏当代人和动物宿主的遗传数据，限制了全球系统地理学框架整合及跨境传播动态理解，鉴于基因型分布和种群结构对寄生虫进化、流行病学及控制策略具有重要意义，研究人员开展了此项研究以填补空白并支持针对性控制策略。研究人员通过对阿富汗法里亚布省牲畜棘球蚴囊样本进行线粒体 cox1 和 nad1 基因测序，并整合 NCBI 全球数据集，分析遗传多样性、种群连通性及进化关系，得出阿富汗分离株以 G1 为主、仅存单株 G3，其种群具中度至高度单倍型多样性（Haplotype diversity, Hd）与低核苷酸多样性，嵌入全球互联传播网络且呈星形单倍型网络与广泛洲际共享，无宿主或地理特异性聚类，G1 谱系全球遗传连贯且 G3 多样性有限，全基因组中性无局部选择性清除，突显牲畜流动与历史扩散塑造当代 CE 流行病学，为中亚南亚提供基线数据并强化全健康（One Health）干预协调需求的重要结论，意义在于填补区域知识缺口并为流行区监测控制提供稳健系统地理学框架。

研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法包括基于阿富汗法里亚布省政府管理的屠宰场自然感染牲畜（牛、绵羊、山羊共 64 份）棘球蚴囊样本的系统性随机采集，使用 Whatman FTA 卡片保存寄生虫材料；提取基因组 DNA 后针对线粒体 cox1 和 nad1 基因进行聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）扩增与双向 Sanger 测序；利用 DNASTAR、Unipro UGENE、BioEdit 进行序列组装、比对及通过 BLASTn 确认物种；从 NCBI GenBank 检索筛选全球 E. granulosus s.s. 线粒体序列并整理元数据；运用 DnaSP 计算单倍型数目、单倍型多样性（Hd）、核苷酸多样性（π）及 Tajima’s D、Fu’s F_s 中性检验，通过 PopART 构建中位连接（Median-joining, MJ）单倍型网络，使用 IQ-TREE、RAxML、MrBayes 进行最大似然与贝叶斯系统发育推断及邻接（Neighbor-joining, NJ）树构建，并开展滑动窗口分析。

研究结果部分保留小标题并说明如下。

3.1. Sample Collection, Molecular Identification, and Continental Distribution of E. granulosus s.s. 研究人员通过对阿富汗法里亚布省 64 份牲畜棘球蚴囊样本进行 PCR 扩增 cox1（1674 bp）与 nad1（894 bp）并测序 BLAST 鉴定，62 份成功表征均为 E. granulosus s.s.，其中 61 份为 G1、1 份为 G3；整合 NCBI 全球序列显示亚洲与欧洲序列代表性最广（分别 20 与 16 国），非洲 10 国，南美 6 国，北美仅 1 国，证实阿富汗样本嵌入全球分布格局。

3.2. Genetic Diversity and H Structure of Afghan E. granulosus Isolates 研究人员分析阿富汗分离株完整 cox1、nad1 及串联序列，分别检出 13、6、11 个多态位点，简约信息位点占比分别为 61.5%、16.7%、54.5%；单倍型（Haplotype, H）数目分别为 9、5、6；MJ 网络显示主导中心单倍型伴低频变异，cox1 中 Afghan-Hap4 最常见（13/33），nad1 中 Afghan-Hap1 占优（12/24），串联数据集中 Afghan-Hap3 最频繁。

3.3. H and Nucleotide Diversity and Neutrality Tests 研究人员计算得出阿富汗种群 cox1、nad1 及串联序列的 Hd 分别为 0.782、0.630、0.817，属中度至高度，而 π 值较低（0.00255–0.00426），表明多密切关联单倍型仅少数突变步分隔；中性检验显示单基因位点 Tajima’s D 与 Fu’s F_s 负向但无统计显著性（p > 0.05），串联数据集略正向，符合弱人口或选择压力下遗传稳定种群。

3.4. Phylogenetic Analysis Based on Concatenated Mitochondrial Sequences 研究人员基于串联 cox1–nad1 序列并以 Taenia saginata (PP391461) 为外群构建系统发育树，所有阿富汗 G1 分离株与全球 G1 参考序列形成高支持单系分支，单株阿富汗 G3 与全球 G3 聚簇分离，确认基因型指派与 G1 遗传独特性；G1 分支内无宿主特异性聚类，羊、牛、山羊来源交织分布。

3.5. Global H Networks, Genetic Diversity, and Phylogeographic Structure 研究人员构建全球 G3 nad1 的 MJ 网络显示紧凑弱结构拓扑，14 序列分 4 单倍型，阿富汗分离株 PV610729 成独特单倍型距亚欧非分离株 1–2 突变步，无地理聚类；G3 仅 3 突变无简约信息位点，Hd 0.396、π 0.00048 极低，Tajima’s D -1.67053、Fu’s F_s -2.288；滑动窗口分析示 G1 的 nad1 与 cox1 的 Tajima’s D 近零或弱负无峰谷，全基因组中性，π 呈单峰微右偏，G3 nad1 π 极低且 Tajima’s D 窄幅围绕零，错配分布尖锐单峰，反映全基因组同质无局部选择性清除与近期共享进化史；全球 G1 nad1 与 cox1 MJ 网络呈显著星形拓扑，1 或多个中心单倍型跨洲共享，低频单倍型辐射而出，cox1 分辨率更高且高频单倍型跨亚欧美非共享，区域特异单倍型低频衍生，地理映射示广泛洲际单倍型共享无清晰大陆隔离；比较 G1 与 G3 遗传多样性，G1 的 cox1（43 株）13 突变 6 单倍型、nad1（31 株）107 突变 10 单倍型，Hd 低至中度（cox1 0.221、nad1 0.546）、π 低（cox1 0.02472、nad1 0.0333），Tajima’s D 显著负（cox1 -2.36964、nad1 -2.78476），Fu’s F_s cox1 负（-2.348）nad1 正（2.036）；G3 各指标一致低多样性。

3.6. Phylogenetic Network Analysis 研究人员基于 G1 的 nad1 与 cox1 及 G3 的 nad1 进行邻接网络（NJ Network, NJN）分析，G1 序列紧密聚簇成致密网络分支少，G3 成独特紧凑簇，基因型间遗传分离清晰且基因型内遗传距离短；人与牲畜来源分离株交织于 G1 网络，无宿主特异性聚类，印证单倍型网络与多样性分析显示的弱系统地理结构与有限宿主相关遗传分化。

讨论部分总结如下。研究人员指出阿富汗 E. granulosus s.s. 以 G1 绝对主导仅单株 G3 反映全球趋势，G1 为五大洲人类与牲畜 CE 最主要致病原；阿富汗种群中度至高度 Hd 伴低 π 为人口扩张种群特征，主导中心单倍型跨宿主地理共享、外周衍生变异辐射的星形网络符合近期快速扩张而非长期隔离，与伊朗巴基斯坦等区域研究一致；中性与滑动窗口分析示全基因组同质、无显著瓶颈或选择性清除，G3 极低 π 与紧密聚类反映窄遗传基础与低全球流行度；串联序列系统发育明确 G1 与 G3 为 distinct mitochondrial lineages 且阿富汗分离株正确聚类，G1 网络无宿主特异分支反映广泛多宿主（polyhost）传播周期；全球 MJ 网络洲际共享常见单倍型仅微突变差异，表明地理扩散由牲畜流动、转场与历史贸易路线驱动而非长期区域隔离，与大规模 mitogenomic phylogeography 识别自历史牲畜枢纽扩散路线一致；综合证据强调 E. granulosus s.s. 种群高连通性与低区域分化，局部控制需结合区域动物流动管制与全健康（One Health）策略，仅靶向单一牲畜物种不足需涵盖犬、牲畜与人类社区的广泛干预。

研究结论（Conclusion）部分翻译如下。本研究提供了法里亚布省乃至阿富汗范围内循环 E. granulosus s.s. 在全球进化背景下的首个整合分子与系统地理学评估。线粒体 cox1 与 nad1 分析证实阿富汗牲畜中 G1 基因型明显占优，仅零星出现 G3，确认经典犬-牲畜传播周期的持续存在。尽管为区域采样，阿富汗分离株在遗传上嵌入全球互联的 E. granulosus s.s. 种群中，这由星形单倍型（H）网络、广泛洲际单倍型（H）共享及极少宿主或地理特异性结构所证明。中度至高度 Hd 与低核苷酸多样性相结合表明是源自有限数目祖先谱系的近期人口扩张，而非长期区域隔离。研究结果突显牲畜流动与人介导的扩散为全球寄生虫传播的主要驱动因素，并强调地理受限控制策略的局限性。通过将阿富汗置于 E. granulosus s.s. 全球系统地理学框架内，本工作为中亚和南亚提供了关键基线数据，并强化了针对犬种群、牲畜管理与跨境动物流动的协调全健康（One Health）干预需求。