E3泛素连接酶SINA3与SINA5调控DEP2的泛素化及蛋白酶体降解以调节水稻粒型与粒重

《Plant Biotechnology Journal》：The E3 Ubiquitin Ligases SINA3 and SINA5 Control DEP2 Ubiquitination and Proteasomal Degradation to Regulate Grain Size and Weight in Rice

　　

粒型是一项关键的农艺性状，然而作物中控制其决定的分子机制仍不完全清楚。虽然近期研究表明OsRING80促进DENSE AND ERECT PANICLE 2（DEP2，亦称SRS1/EP2/OsRELA/SUG1）降解以介导免疫而不影响生长发育，研究人员的工作鉴定了一个不同的调控粒发育的途径。研究人员证实两个RING finger类型的E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligases），SEVEN IN ABSENTIA 3（SINA3）与SEVEN IN ABSENTIA 5（SINA5），在翻译后水平调控DEP2的稳定性以调节粒型。SINA3与SINA5与DEP2发生物理互作，该互作特异性由DEP2含有卷曲螺旋（coiled-coil）结构域的C1结构区域介导。这些E3连接酶促进DEP2的K48连接的聚泛素化（K48-linked polyubiquitination），靶向其进行蛋白酶体降解。液相色谱-质谱（LC–MS）分析鉴定出DEP2内六个关键的赖氨酸残基（K399、K722、K746、K958、K962和K1344）对其泛素化及随后的去稳定化至关重要。研究人员的遗传证据进一步支持该调控模块：敲除SINA3和/或SINA5导致DEP2积累，同时显著增加粒型与千粒重，而不改变其他农艺性状；反之，过表达SINA3或SINA5降低DEP2蛋白水平并减小粒型与粒重。因此，研究人员的研究揭示了一个新的翻译后调控模块，其中SINA3与SINA5控制DEP2稳定性以微调粒发育。这些发现为通过操纵该翻译后调控节点以优化谷物产量提供了一种有前景的策略。

该研究发表于《Plant Biotechnology Journal》。水稻作为全球粮食安全的重要支柱，其产量受粒长、粒宽、粒厚及灌浆速率等粒型性状的直接影响，这些均属于受多基因控制的复杂数量性状。目前虽已克隆众多粒型相关基因与数量性状位点（QTLs），并知晓其参与泛素-蛋白酶体途径、G蛋白信号、MAPK级联、植物激素途径及转录调控等网络，但这些基因调控粒型与重量的分子机制及其在综合遗传网络中的整合仍很大程度上未知。特别地，植物特有蛋白DEP2（亦作SRS1、EP2、OsRELA、SUB1）对植株生长、穗结构与粒型起关键作用，其稳定性受翻译后调控，此前已知OsRING80靶向DEP2降解以平衡免疫与生长，但在粒发育过程中调控DEP2蛋白稳定的具体机制尚未阐明。在此背景下，研究人员通过开展研究，获得DEP2/SRS1的新等位突变体dep2-3，利用酵母双杂交筛选鉴定出与其互作的RING finger E3泛素连接酶SINA3与SINA5，系统揭示了SINA3/5-DEP2模块通过26S蛋白酶体途径调控水稻粒型与重量的分子机理，得出SINA3和SINA5是粒型与重量的负调控因子、敲除二者可提升DEP2稳定性从而增大籽粒的重要结论，为通过翻译后修饰靶点改良作物产量提供了新策略与理论基础。

为开展研究，研究人员主要采用以下关键技术方法：以水稻Kitaake品种为野生型及转基因分析材料，利用酵母双杂交（Y2H）筛选DEP2互作蛋白；通过体外谷胱甘肽S转移酶pull-down、双分子荧光互补（BiFC）及体内免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白互作；开展体外泛素化 assay 鉴定连接类型与位点，结合液相色谱-质谱（LC–MS）分析DEP2泛素化位点；利用CRISPR-Cas9构建sina3-cr、sina5-cr单突变体及sina3 sina5双突变体，并制备OE-SINA3、OE-SINA5过表达株系；通过免疫印迹检测DEP2蛋白积累水平；借助扫描电子显微镜（SEM）观察稃片表皮细胞形态并量化细胞长宽与数目；采用RT-qPCR分析基因表达模式；开展无细胞蛋白降解实验验证蛋白酶体依赖的降解途径。

研究结果如下：

2.1 SINA3与SINA5与DEP2发生物理互作

研究人员通过酵母双杂交筛选出SINA5与DEP2互作，并验证SINA3同样与DEP2特异性互作。结构域划分表明互作依赖于DEP2的C端C1区段（氨基酸690–1024），该区含卷曲螺旋结构。体外pull-down、体内BiFC及Co-IP实验均证实二者在胞质与核内共定位并物理结合，且蛋白酶体抑制剂MG132增强该互作信号。

2.2 SINA3与SINA5在体外泛素化并稳定DEP2

体外泛素化体系显示GST-SINA3与GST-SINA5具有自泛素化活性，并能高效催化全长DEP2及DEP2^C1的K48连接聚泛素化，而非K63连接。无细胞降解实验中，sina3 sina5双突变体提取蛋白使His-DEP2-Flag降解显著慢于野生型，加入MG132后野生型降解率降至双突变体水平，证明SINA3/5通过26S蛋白酶体途径靶向DEP2降解，且SINA3活性强于SINA5，二者异源二聚化后活性介于单体之间。

2.3 SINA3在C1域泛素化DEP2且六个赖氨酸位点贡献泛素化

LC–MS鉴定出DEP2全长上六个泛素化赖氨酸残基K399、K722、K746、K958、K962、K1344，其中K722、K746、K958、K962位于C1域内。构建K958R、K962R及双位点突变体后在原生质体中表达，发现突变体泛素化水平降低且DEP2^C1蛋白积累增加，证实C1域是互作与泛素化主要区域，K958与K962是关键位点。

2.4 SINA3/5功能缺失促进细胞扩张从而增加粒型

CRISPR-Cas9获得的单双突变体粒宽与千粒重显著增加，粒长略增但不显著，株高等其余性状不变。免疫印迹显示突变体中DEP2蛋白积累显著升高。SEM观察稃片细胞宽度增加，长度与纵横细胞数无显著变化，表明SINA3/5通过调控DEP2稳定性调节细胞扩张。单突变体中另一SINA成员表达上调，提示功能冗余与补偿效应。

2.5 SINA3/5泛素化DEP2以控制水稻粒型

RT-qPCR显示DEP2在穗发育早期上升，SINA3/5表达峰值晚于DEP2，暗示后期发挥刹车作用。过表达SINA3或SINA5显著降低DEP2蛋白水平，导致粒长、粒宽、千粒重及株高、穗长下降，但表型轻于dep2-3缺失突变，且在dep2-3背景下过表达SINA5无额外表型，证明DEP2位于SINA5下游。SEM显示过表达株系稃片细胞长宽均减、纵向细胞数减少，表明SINA3/5通过协同抑制细胞扩张与纵向增殖限制粒生长。

讨论部分总结：

研究人员在讨论中指出，粒型与重量是谷类作物产量核心决定因子，DEP2已知调控稃片细胞扩张与增殖并通过GA与BR信号等途径整合发育，OsRING80虽促DEP2降解但专司免疫不影响发育。本研究阐明SINA3/5通过控制DEP2稳定性调控粒型的途径区别于OsRING80-DEP2免疫模块。过表达SINA3/5大幅降低DEP2并损害农艺性状，SEM显示细胞扩张受限是粒变小主因，与已知dep2突变体表型一致，且SINA3/5还影响整体植株生长，支持二者与DEP2在同一遗传通路。突变体表型不对称源于SINA3与SINA5表达互补及其他E3参与降解的补偿机制，而过表达使DEP2低于功能阈值故表型剧烈。不同于SINARs介导OsER1的K63泛素化，SINA3/5催化DEP2的K48连接泛素化，C1域为主要互作与修饰区，非互作区也存在位点提示DEP2空间构象复杂。SINA家族具多样功能，本研究显示DEP2特异性互作SINA3/5而非全部成员，粒宽增加可能涉及OsER1等其他底物稳态扰动。SINA3较SINA5活性更强，源于RING域六个氨基酸差异如第148位C vs Y，影响酶活性。研究人员提出工作模型：SINA3/5负调控粒型重量，过表达促DEP2降解致粒变小减重，双突变使DEP2积累延缓降解促进细胞扩张增大粒型重量，上游触发SINA3/5降解的信号尚待研究，该模块为作物产量改良提供宝贵靶点。

研究结论部分翻译：

基于分子与遗传证据，研究人员提出一个工作模型以展示SINA3/SINA5-DEP2调控模块如何支配水稻粒型与重量。SINA3与SINA5通过介导DEP2经26S蛋白酶体途径降解来负调控粒型与重量，从而共同调节稃片中的细胞扩张与增殖。然而，触发SINA3/5降解的上游分子信号仍不清楚，这是未来研究的关键方向。总之，研究人员的发现揭示了一个关键的SINA3/SINA5-DEP2调控模块，其支配水稻粒型与重量，代表了一个通过翻译后调控改善作物谷物产量的有价值靶点。