《One Health Advances》：Prevention of tight-junction disruption via enhancement of ROBO4 attenuates influenza-induced blood-brain barrier injury
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本研究旨在阐明Roundabout 4（ROBO4）在流感病毒诱导的屏障功能障碍期间维持血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）完整性中的保护作用。研究人员利用体内和体外流感感染模型检测了ROBO4的功能作用。具体而言，机制研究聚焦于病毒诱导
本研究旨在阐明Roundabout 4（ROBO4）在流感病毒诱导的屏障功能障碍期间维持血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）完整性中的保护作用。研究人员利用体内和体外流感感染模型检测了ROBO4的功能作用。具体而言，机制研究聚焦于病毒诱导的ROBO4下调及其对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-VEGF受体2（VEGFR2）/磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）信号轴以及关键紧密连接（tight junction，TJ）蛋白（包括Claudin-1、Occludin和Claudin-5）的后续影响。此外，研究人员利用慢病毒介导的ROBO4过表达来验证其潜在的保护功效。结果显示，流感病毒感染显著下调ROBO4表达，进而增强VEGF与其受体VEGFR2之间的相互作用。因此，这一分子事件触发了PI3K/AKT/eNOS信号级联反应，导致TJ蛋白耗竭及随后的BBB完整性受损。值得注意的是，ROBO4过表达有效抑制了VEGF-VEGFR2相互作用，抑制了PI3K/AKT/eNOS通路的激活，并恢复了Claudin-1和Occludin的表达水平，从而维持了屏障功能。总体而言，通过将ROBO4确定为BBB完整性的关键调节因子，本研究强调了其作为新型治疗靶点的潜力。此外，这些发现为制定预防和干预策略以减轻流感病毒感染相关的神经系统并发症提供了理论支持。
研究背景方面，流感病毒主要靶向呼吸道上皮，但其急性感染常伴随发热惊厥、脑炎和急性脑病等严重神经系统并发症，在儿童群体中尤为高发，且在2009 H1N1大流行及高致病性H5N1禽流感感染中均有相关脑炎临床表现及脑组织检出病毒的报道。然而，流感病毒感染诱发神经系统并发症的精确致病机制仍不清楚。血脑屏障（BBB）由脑微血管内皮细胞单层及紧密连接（TJ）等构成，精确调控中枢神经系统微环境，阻断病原体与毒素入脑。神经嗜性病原体可破坏脑微血管结构致BBB功能障碍，流感病毒不仅可直接入侵脑微血管内皮细胞复制造成损伤，还可通过氧化应激、凋亡、免疫应答等削弱TJ蛋白Occludin、Claudin-5等表达，增加BBB通透性引发神经炎症。Roundabout 4（ROBO4）是内皮特异性受体，可调节TJ蛋白表达、抑制血管内皮生长因子（VEGF）下游信号从而影响血管通透性，在视网膜、脑缺血再灌注、手术性脑损伤、血肿瘤屏障等多种场景中被证实可调控脑微血管内皮通透性与BBB完整性，但其在流感病毒感染诱导的神经系统疾病中的作用尚不明晰。因此，探究ROBO4在流感病毒感染下对BBB的调控机制具有重要科学与临床价值，该研究发表于《One Health Advances》。
关键技术方法方面，研究人员采用体内与体外流感感染模型，体内使用雌性BALB/c小鼠经鼻接种A/WSN/33（H1N1）病毒构建感染模型，体外使用小鼠脑内皮细胞系bEnd.3与H1N1病毒共培养；通过慢病毒介导ROBO4过表达及siRNA介导ROBO4敲低调控其表达；运用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达与磷酸化水平，实时荧光定量逆转录PCR（RT-qPCR）检测基因转录水平，免疫荧光染色观察TJ蛋白分布，跨上皮电阻（TEER）测量内皮通透性，共免疫沉淀（Co-IP）分析VEGF与VEGFR2相互作用，伊文思蓝（Evans blue）渗出实验评估体内血管通透性，苏木精—伊红（H&E）染色进行组织病理分析，并使用AKT抑制剂MK-2206进行通路抑制验证。
研究结果部分保留原文小标题依次如下。
Impact of WSN/H1N1 virus infection on mice: physiological and pathological changes。研究人员通过体内小鼠感染实验发现，H1N1感染后小鼠体重进行性下降，脑与肺脏器系数显著升高，肺组织充血水肿且湿干重比增加，脑组织虽无显著湿干重比变化但H&E染色显示结构疏松、水肿、空泡化、细胞肿胀、核模糊及血管周间隙增宽等脑水肿与病毒性脑炎特征；RT-qPCR检测显示小鼠脑微血管内皮细胞中流感病毒核蛋白（NP）基因表达显著升高，证实病毒在该细胞中成功复制。
Effect of influenza virus on TJs and endothelial permeability in the cerebral microvasculature。研究人员通过体内伊文思蓝渗出实验发现感染小鼠脑内染料含量显著升高，提示BBB通透性增加；免疫荧光与Western blot显示脑组织中Claudin-1、Occludin荧光强度与蛋白水平显著下调，脑组织中检出H1N1 NP证实病毒感染；体外bEnd.3细胞实验中，跨上皮电阻（TEER）随感染时间渐进性下降，Western blot同样证实Claudin-1、Occludin表达下调，表明H1N1感染通过破坏TJ复合物直接增加脑微血管内皮通透性。
Viral infection downregulates ROBO4 and activates downstream signaling。研究人员在体内实验中通过RT-qPCR与Western blot发现，感染小鼠脑组织中ROBO4 mRNA与蛋白水平显著下调，同时VEGF/VEGFR2介导的信号增强，PI3K/AKT/eNOS通路磷酸化水平升高，eNOS磷酸化与TJ蛋白Claudin-1、Occludin降解密切相关；体外bEnd.3细胞感染亦得到一致结果，ROBO4 mRNA与蛋白下调，VEGF-VEGFR2信号增强、PI3K/AKT/eNOS级联激活及eNOS磷酸化增加伴随TJ蛋白降解，提示H1N1感染通过转录水平下调ROBO4触发信号级联致TJ蛋白降解与BBB受损。
ROBO4 maintains endothelial barrier integrity via modulation of the VEGF/PI3K/AKT/eNOS axis。研究人员通过慢病毒转导使bEnd.3细胞ROBO4过表达效率超80%，基础条件下过表达细胞TEER显著升高；H1N1感染期间ROBO4过表达有效减弱TEER下降，Western blot显示Occludin、Claudin-1表达恢复；Co-IP显示ROBO4过表达减弱病毒感染增强的VEGF-VEGFR2相互作用，Western blot证实PI3K/AKT/eNOS通路磷酸化降低；使用AKT抑制剂MK-2206处理感染细胞可恢复Occludin、Claudin-1、Claudin-5表达并提升TEER维持屏障完整性；反之，未感染细胞中siRNA敲低ROBO4会增强VEGF-VEGFR2相互作用、激活PI3K/AKT/eNOS轴、下调Occludin、Claudin-1、Claudin-5表达并降低TEER增加通透性，证实ROBO4下调通过PI3K/AKT/eNOS通路介导内皮通透性增加。
讨论部分总结，研究人员指出BBB是分隔中枢神经系统的复杂多细胞血管结构，流感病毒可侵染神经系统损伤BBB，但ROBO4等关键调控蛋白的作用机制不清；本研究确认ROBO4是流感感染期间BBB完整性的关键保护因子，病毒感染下调TJ蛋白增加旁细胞通透性，内皮细胞ROBO4过表达可防止连接破坏减轻BBB损伤；既往研究已证实流感病毒可侵染中枢并损害BBB，TJ蛋白缺陷与多种神经疾病相关，其他病毒如登革病毒、柯萨奇A16病毒也通过靶向TJ蛋白破坏BBB，而本研究明确流感病毒感染脑血管内皮细胞下调TJ蛋白破坏BBB功能致脑水肿与炎症浸润，保护TJ蛋白对防治病毒性脑病至关重要；ROBO4既往在肺部感染、血肿瘤屏障中被证可调控血管稳定，本研究首次明确其为脑微血管中流感病毒的靶标，其下调致Claudin-1、Occludin、Claudin-5耗竭破坏BBB，过表达ROBO4可恢复TJ蛋白减轻高通透性；ROBO4通过调控VEGF信号维持血管稳定，其过表达抑制VEGF-VEGFR2交互与PI3K/AKT/eNOS激活减轻通透，符合Slit2/ROBO4拮抗VEGF驱动通透的机制，ROBO4缺失使VEGF通路失控致病理性渗漏，其下调可能涉及转录、miR-140-5p等转录后调控及ADAM10、ADAM17蛋白水解脱落，值得深入探究以拓展诊疗策略。
研究结论部分翻译如下：总之，本研究表明流感病毒感染在血脑屏障处下调ROBO4，进而增强VEGF/VEGFR2信号传导以激活PI3K/AKT/eNOS通路，该级联反应最终导致紧密连接蛋白降解并随之增加BBB通透性。关键的是，本研究将ROBO4确定为一个关键的保护节点，提示其稳定可维护BBB完整性并减轻相关的神经损伤。
