去泛素化酶CYLD通过抑制凝血酶诱导的p38 MAPK–p65 NF-κB信号传导及炎性细胞因子产生来抑制三阴性乳腺癌进展

《Journal of Biological Chemistry》：The deubiquitinase CYLD inhibits thrombin-induced p38 MAPK–p65 NF-κB signaling and inflammatory cytokine production to suppress triple-negative breast cancer progression

　　

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一种侵袭性亚型，其特征为慢性炎症且治疗选择有限。尽管凝血酶对蛋白酶激活受体1（protease-activated receptor 1，PAR1）的激活可在内皮细胞中促进依赖泛素（ubiquitin-dependent）的信号传导和炎症反应，但其对TNBC中炎症效应的作用仍知之甚少。研究人员表明，去泛素化酶圆柱瘤病蛋白（cylindromatosis，CYLD）的缺失可显著提高p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）及核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p65亚基的基础磷酸化水平，使之达到与凝血酶刺激相当的程度，且凝血酶不能进一步增强该效应，这提示CYLD主要限制组成性炎症活性。研究还表明，在TNBC中，凝血酶激活PAR1通过依赖自磷酸化（autophosphorylation-dependent）的机制促进p38信号传导，进而诱导p65 NF-κB亚基磷酸化及核内积累，且该过程不依赖经典性κB抑制蛋白α（inhibitor of κBα，IκBα）降解。该非经典信号传导驱动促炎性白细胞介素（interleukin，IL）细胞因子表达，包括IL-6、IL-8、IL-1α和IL-1β。在功能上，IL-6和IL-8分别促进凝血酶诱导的TNBC细胞增殖和迁移。综上，这些发现界定了一条新的受CYLD调控的PAR1–p38–p65信号轴，该信号轴促进炎性细胞因子产生及肿瘤相关表型，如细胞增殖和迁移，并鉴定出多个可用于侵袭性乳腺癌治疗靶向的可成药节点。

该文发表于《Journal of Biological Chemistry》，围绕三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）中的炎症驱动机制展开，重点解析凝血酶（thrombin）-蛋白酶激活受体1（protease-activated receptor 1，PAR1）信号如何连接至p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）和核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p65亚基，并进一步诱导炎性细胞因子表达及肿瘤进展表型。TNBC缺乏雌激素受体、孕激素受体及HER2表达，临床上具有侵袭性强、易早期复发、预后差和缺乏有效靶向治疗等特点。慢性炎症被认为是推动TNBC进展和转移的重要因素，尤其是IL-6和IL-8等细胞因子与细胞存活、迁移及耐药密切相关。然而，G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）上游炎症信号如何在TNBC中精确驱动p38激活及炎症因子产生，仍缺乏清晰机制。研究人员因此聚焦于在TNBC中高表达的PAR1，以及已知具有去K63连接泛素链活性的去泛素化酶CYLD，系统阐明其在非经典炎症信号中的抑制作用。

在技术路径上，研究人员主要采用多种TNBC细胞系模型，包括MDA-MB-231、BT549和Hs578T细胞；联合使用药理学抑制剂、siRNA瞬时敲低、免疫印迹（western blot）、共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）、共聚焦免疫荧光、RT-qPCR、TaqMan细胞因子芯片、分泌型细胞因子阵列、细胞增殖检测和Transwell迁移实验等方法，对PAR1-p38-p65信号轴、CYLD调控作用及其功能后果进行验证。研究未涉及患者样本队列，主要基于体外细胞模型完成。

Thrombin induces PAR1-dependent p38 MAPK autophosphorylation in TNBC cells
研究首先证明凝血酶可在三种TNBC细胞系中稳定诱导p38 Thr¹⁸⁰/Tyr¹⁸²磷酸化，峰值出现在7.5至15 min。应用PAR1选择性拮抗剂vorapaxar后，这一效应显著减弱，说明PAR1是凝血酶作用于TNBC细胞的主要受体。进一步采用p38抑制剂BIRB 796后，凝血酶诱导的p38磷酸化几乎被完全阻断，提示该过程依赖p38自磷酸化，而非单纯由上游MAPK激酶介导。由此，研究确立了TNBC中存在一条PAR1依赖的p38自磷酸化炎症信号通路。

Thrombin-induced p38 phosphorylation drives p65 phosphorylation and nuclear translocation
随后，研究人员检验p38与p65之间的上下游关系。药理学抑制p38或使用两条不同siRNA敲低p38均可显著降低凝血酶诱导的p65 Ser⁵³⁶磷酸化，支持p38位于p65上游。相反，使用低剂量BAY 11-7082抑制p65，或以siRNA敲低p65，均不影响凝血酶诱导的p38磷酸化，说明p65并非p38激活所必需。共聚焦成像进一步显示，凝血酶刺激后p65由胞质向细胞核明显转位，而p38抑制或p65抑制都可阻止这一过程，表明凝血酶通过p38驱动p65活化和核转位。

p38 and p65 form a pre-existing complex that is thrombin enhances phosphorylation independently of IκBα degradation
关于p65被激活的具体形式，研究发现凝血酶刺激并不引起经典NF-κB通路所需的IκBα降解，但却可在7.5和15 min明显诱导p38及p65磷酸化，提示存在非经典激活机制。共免疫沉淀结果显示，在未刺激状态下，细胞内已存在基础性的p38-p65复合物；凝血酶刺激后，该复合物内p38和p65的磷酸化水平显著增强。正反向共免疫沉淀均支持这一结论。该部分结果表明，TNBC细胞中p38与p65形成预存复合物，凝血酶可在不依赖IκBα降解的条件下促进该复合物内两者磷酸化，从而实现NF-κB非经典激活。

CYLD restrains basal p38 autophosphorylation and activation of p65 NF-κB subunit phosphorylation in TNBC
在CYLD调控层面，研究人员以两条CYLD特异siRNA在MDA-MB-231细胞中降低CYLD表达，观察到p38和p65在基础状态下的磷酸化显著升高，且已接近凝血酶刺激水平，之后再加凝血酶也不再进一步增强。该现象在BT549细胞中得到重复验证，说明CYLD主要发挥限制基础性、组成性炎症信号的作用。进一步使用BIRB 796后，CYLD缺失所引起的基础高磷酸化被抑制，表明这种升高依赖p38自磷酸化机制。由此可见，CYLD是TNBC细胞中限制p38-p65信号轴基础活性的关键负调节因子。

Thrombin induces p38-dependent pro-inflammatory cytokine expression, while CYLD restrains basal cytokine levels in TNBC cells
在转录与分泌输出层面，TaqMan Array Human Cytokine Network显示，在检测的28种炎症因子中，IL-6、IL-8、IL-1α和IL-1β的mRNA受凝血酶诱导最为显著，并在2 h达到峰值，6 h后下降。单基因RT-qPCR验证了这些变化。分泌型细胞因子阵列进一步显示，蛋白水平上IL-6和IL-8分泌增加最为明显，而IL-1α和IL-1β分泌较弱。应用BIRB 796可消除凝血酶诱导的IL-6和IL-8 mRNA升高，说明该过程依赖p38。与此同时，CYLD敲低可提高IL-6和IL-8基础表达，而这种升高同样被BIRB 796抑制，说明CYLD通过抑制p38活性来限制基础炎症因子表达。且在CYLD缺失背景下，凝血酶不能进一步提升IL-6和IL-8，提示信号已处于近饱和状态。

Thrombin promotes p38-dependent MDA-MB-231 cell proliferation, while CYLD restrains basal proliferation and IL-6 contributes to these responses
功能实验表明，CYLD敲低可将MDA-MB-231细胞基础增殖提高到与凝血酶处理相近的水平，提示CYLD具有抑癌作用并限制基础增殖。尽管如此，凝血酶在CYLD缺失细胞中仍可进一步促进增殖，说明除p38外可能还存在其他促增殖信号贡献。p38抑制剂BIRB 796显著抑制基础增殖、CYLD缺失引起的高增殖及凝血酶诱导增殖，证实p38是关键介导者。进一步，研究利用IL-6中和抗体和重组IL-6开展验证：IL-6可诱导Akt Ser⁴⁷³磷酸化并促进细胞增殖，而中和IL-6后，IL-6本身及凝血酶诱导的增殖均被削弱。这说明IL-6是凝血酶-p38-p65炎症轴促进TNBC细胞增殖的重要下游效应分子。

p38-dependent TNBC cell migration is enhanced by thrombin and elevated by CYLD depletion, with contributions from IL-8
迁移实验显示，凝血酶可显著促进MDA-MB-231细胞迁移；CYLD敲低则提高基础迁移能力至与凝血酶处理相近的水平，且凝血酶不再带来额外增强。BIRB 796在所有条件下均可抑制迁移，表明迁移依赖p38活性。针对IL-8的功能检验发现，重组IL-8可促进Akt磷酸化和细胞迁移，而IL-8中和抗体可抑制基础迁移、凝血酶诱导迁移及IL-8本身诱导的迁移。这说明在该炎症信号轴的下游，IL-8是介导TNBC细胞迁移的重要效应因子。

综合讨论部分，研究人员提出，TNBC中存在一条非经典的凝血酶-PAR1-p38-p65信号通路。与经典NF-κB依赖IκBα降解不同，该通路通过p38自磷酸化驱动预存p38-p65复合物内p65磷酸化和核转位，从而诱导炎症转录程序。CYLD作为去泛素化酶，在该体系中主要限制基础性p38与p65活化，并抑制IL-6、IL-8等促炎细胞因子的产生，进而抑制增殖和迁移等肿瘤相关表型。研究还指出，尽管CYLD已知可去除TRAF2、NEMO、RIPK1和TAK1等分子的K63连接泛素链，但本研究并未确定TNBC中具体参与调节该信号轴的直接底物，因此机制上仍保留待解析空间，不过对于文中结论并无影响。

研究结论部分可概括为：研究人员鉴定出CYLD是TNBC细胞中凝血酶激活PAR1-p38-p65 NF-κB亚基信号轴的关键负调节因子；凝血酶通过依赖p38自磷酸化的机制激活p65并促进其核转位，且该过程独立于IκBα降解；CYLD缺失会放大p38和p65磷酸化，导致持续性炎性细胞因子产生，并增强TNBC细胞增殖和迁移。总体而言，该研究揭示了一种此前未被充分认识的非经典GPCR炎症信号模式，并指出PAR1、p38、p65以及下游IL-6、IL-8相关环节均可能成为侵袭性TNBC的潜在治疗靶点。