GRIP结构域在α-、β-、γ-和δ-ENaC中的不同功能作用

《Journal of Biological Chemistry》：Distinct functional roles of the GRIP domains in α-, β-, γ- and δ-ENaC

　　

上皮钠通道（ENaC）是一种异源三聚体，通常由三个同源亚基（α、β和γ）组成。人类和其他几种物种表达一个额外的δ-亚基，该亚基可以在异源表达系统中替代α-ENaC，从而改变通道特性。ENaC的一个独特特征是其蛋白水解激活。蛋白酶从α-和γ-ENaC的蛋白水解抑制解除门控（GRIP）结构域中移除自身抑制片段。最近的ENaC结构数据揭示，这些片段占据各自亚基内的特定结合口袋。利用分子动力学模拟、定点诱变和电生理记录，研究人员在人类αβγ-ENaC的γ-自身抑制片段的结合口袋内鉴定了一个由四个功能重要的芳香族残基组成的簇。这些残基对于合成γ-11肽（对应于γ-抑制片段的关键部分）抑制ENaC也是必需的。该芳香族簇在α-ENaC中是保守的，并在其中介导了合成α-8肽的抑制效应。有趣的是，在δ-和β-ENaC中也鉴定出了结构相似的GRIP结构域。研究人员的数据表明，β-和δ-ENaC的GRIP结构域均缺乏相应的自身调节片段。此外，研究人员显示，人类δβγ-ENaC的蛋白水解激活源于γ-ENaC的切割，而非δ-ENaC的切割，这与δ-GRIP结构域缺乏自身调节活性一致。总之，本研究证明GRIP结构域在不同ENaC亚基中发挥不同的功能作用。对γ-和α-ENaC中抑制位点的表征可能有助于开发具有潜在（病理）生理意义的新型肽模拟ENaC抑制剂。

**论文解读文章**

**研究背景、问题与意义**
上皮钠通道（ENaC）属于ENaC/退化蛋白家族，是介导上皮顶端钠离子转运的关键通道，在维持钠稳态、控制细胞外容量和调节长期血压中发挥核心作用。其功能异常与多种疾病密切相关，如Liddle综合征（假性醛固酮增多症）、假性低醛固酮增多症（PHA1）、囊性纤维化等。ENaC通常由α、β、γ三个亚基组成异源三聚体（αβγ-ENaC），但人类等物种还表达一个δ-亚基，可在异源系统中替代α-ENaC形成δβγ-ENaC，并改变通道特性。ENaC的一个独特调控机制是蛋白水解激活：蛋白酶切除α和γ亚基GRIP结构域中的自身抑制片段，从而解除抑制。近期冷冻电镜结构解析了αβγ-ENaC和δβγ-ENaC的结构，揭示了GRIP结构域中P1片段（自身抑制片段的关键部分）占据由指状结构域、GRIP结构域和拇指结构域形成的结合口袋。然而，这些结合口袋内关键氨基酸残基的功能重要性、β和δ亚基中GRIP结构域是否具有自身调节功能，以及δβγ-ENaC蛋白水解激活是否依赖于δ亚基切割等问题尚不清楚。为此，研究人员开展了本研究，旨在阐明不同ENaC亚基中GRIP结构域的功能差异，为开发新型ENaC抑制剂提供分子基础。本论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用分子动力学（MD）模拟（基于蛋白质数据库【PDB】结构6WTH和9BLR），结合定点诱变、双电极电压钳（TEVC）电生理记录（在非洲爪蟾卵母细胞异源表达体系中进行）以及细胞表面生物素化与免疫印迹分析，系统研究了人类ENaC各亚基中GRIP结构域的功能。样本来源为非洲爪蟾卵母细胞，无队列来源。

**研究结果**
**1. α、β、γ、δ-ENaC中GRIP结构域的结构相似性**
通过MD模拟分析，研究人员发现所有四个亚基的P1片段（β亚基为P1/P2片段）在500纳秒模拟中均与其结合口袋稳定结合。在γ和α亚基中，四个保守芳香族残基（γPhe204、γTrp229、γHis233、γTyr425；αPhe226、αTrp251、αHis255、αTyr447）对P1协调起关键作用；δ亚基中存在三个类似残基（δPhe207、δTrp232、δHis236），但拇指结构域贡献减少；β亚基仅有一个芳香族残基（βTrp218）参与稳定，其余位置由极性或疏水残基替代。所有亚基中，指状结构域α2-螺旋的保守色氨酸与P1片段中的保守亮氨酸形成稳定疏水接触。

**2. γ-ENaC中P1结合口袋的保守芳香族残基对γ-自身抑制片段和合成γ-11肽抑制通道至关重要**
研究人员在非洲爪蟾卵母细胞中表达野生型（WT）和突变型（γF204A、γW229A、γH233A、γY425A）人类αβγ-ENaC，通过TEVC记录电流。结果：所有突变体基线电流显著升高，且糜蛋白酶刺激效应减弱（γF204A、γH233A部分减弱，γW229A、γY425A几乎消失），而Western blot显示γ亚基表达和切割模式无显著变化，表明突变通过破坏自身抑制片段与结合口袋的相互作用而模拟了蛋白水解激活。此外，糜蛋白酶后应用γ-11肽的抑制效应在所有突变体中显著降低。进一步对P1片段内残基（γIle158、γLeu160等）进行丙氨酸替换，发现γI158A和γL160A也导致基线电流升高和糜蛋白酶刺激效应减弱，证实了这些残基在抑制中的关键作用。

**3. α-ENaC中P1结合口袋的保守芳香族残基对α-8肽抑制通道的功能重要性**
由于WT α-ENaC在卵母细胞表面已被内源furin酶完全切割，缺乏自身抑制片段，研究人员直接测试α-8肽的抑制效应。αF226A、αW251A、αH255A、αY447A突变体的基线电流显著降低，Western blot排除表达变化，而Na⁺自抑制分析显示突变体稳态/峰值电流比降低，表明Na⁺自抑制增强。重要的是，α-8肽的浓度依赖性抑制效应在所有突变体中显著减弱，以αF226A和αW251A最为显著。

**4. 从β-ENaC GRIP结构域移除P1/P2片段不改变ENaC电流**
研究人员在β-ENaC的P1/P2片段两侧引入凝血酶切割位点，并用胰蛋白酶处理以切除该片段。为排除γ亚基切割的干扰，使用二硫键锁定γ-ENaC突变体（γS155C-Q426C）使其对蛋白水解激活不敏感。Western blot确认胰蛋白酶成功切割β-ENaC产生预期片段，但TEVC记录显示，无论是否切割，ENaC电流均无显著变化，表明β-ENaC的P1/P2片段不具有自身调节功能。

**5. δβγ-ENaC的蛋白水解激活源于γ-ENaC切割而非δ-ENaC切割**
使用二硫键锁定γ-ENaC突变体与WT δ-和β-ENaC共表达。糜蛋白酶处理不能激活该通道，除非用DTT还原二硫键后恢复激活。Western blot显示糜蛋白酶可切割δ-ENaC产生约65 kDa片段，但电流无刺激效应。对比实验：使用α-ENaC突变体（αFM，突变furin切割位点）与二硫键锁定γ-ENaC共表达，糜蛋白酶切割α-ENaC后电流增加约4倍，证实α亚基切割促进激活，而δ亚基切割不参与。

**6. 从δ-ENaC GRIP结构域移除P1片段不改变ENaC电流**
在δ-ENaC的P1片段两侧引入凝血酶切割位点，并用胰蛋白酶处理。在使用二硫键锁定γ-ENaC的条件下，Western blot确认δ-ENaC被切割（产生约65 kDa和约60 kDa片段），但TEVC记录显示所有δβγ-ENaC变体的基线电流和胰蛋白酶效应均无显著差异，表明δ-ENaC的P1片段不具有自身调节功能。

**讨论与结论**
讨论部分总结了研究的关键发现：γ-和α-ENaC中保守芳香族残基形成P1片段结合口袋，介导自身抑制和合成肽的抑制效应；β-和δ-ENaC的GRIP结构域缺乏相应的自身调节片段；δβγ-ENaC的蛋白水解激活仅由γ-亚基切割介导，δ-亚基切割无功能贡献。这些结果验证并细化了现有ENaC结构模型，解释了蛋白水解激活的分子机制。研究还指出，β-亚基可能主要提供结构支架，而δ-亚基虽不参与蛋白水解激活，但其替换α-亚基可诱导构象重排增强基础活性。鉴定出的抑制位点（芳香族簇）为基于结构设计新型肽模拟ENaC抑制剂提供了靶点，有望改善现有药物（如阿米洛利、氨苯蝶啶）的特异性差和药代动力学缺陷，具有潜在的（病理）生理意义。

翻译研究结论部分：总之，本研究提高了研究人员对ENaC蛋白水解激活分子机制的理解。特别是，结果表明，与α-和γ-亚基不同，β-和δ-亚基的GRIP结构域不含自身调节片段。此外，δ-ENaC不参与δβγ-ENaC的蛋白水解激活，该激活由γ-亚基的切割介导。合成的γ-11和α-8抑制肽可能通过相同的结合位点发挥作用，这些位点被未切割的γ-和α-亚基中相应的自身抑制片段所占据。鉴定这些结合位点内的关键芳香族残基可能有助于开发具有潜在（病理）生理意义的新型肽模拟ENaC抑制剂。