公共队列分析鉴定Thyroglobulin（Tg）变异体作为Hypothyroidism风险因素

《Journal of Biological Chemistry》：Public Cohort Analysis Identifies Thyroglobulin Variants as Hypothyroidism Risk Factors

　　

Hypothyroidism是一种普遍的内分泌疾病，其特征为甲状腺激素（T3、T4）产生不足。Thyroglobulin（Tg）是T3和T4合成的前体激素，由于Tg基因的遗传多样性，许多变异体的临床意义尚不明确。研究人员利用大规模All of Us生物样本库研究普遍但未充分表征的Tg变异体与疾病的关联，将变异体存在情况与促甲状腺激素（Thyroid-Stimulating Hormone，TSH）水平及左甲状腺素（Levothyroxine，LT4）使用情况作为甲状腺功能的替代指标相关联。该研究识别出与LT4使用增加及甲状腺功能下降相关的R152H、Q870H、A993T、P1012L和P1494L变异体，而R320C变异体与甲状腺功能下降相关。Fisher大鼠甲状腺细胞的分子表征显示R152H、Q870H和R320C变异体的分泌效率降低。亲和纯化-质谱（Affinity Purification-Mass Spectrometry，AP-MS）表明分泌缺陷变异体与蛋白稳态（Proteostasis）网络的相互作用增强，提示蛋白质量控制缺陷是病理生理机制。相比之下，分泌功能正常的A993T和P1494L变异体与降解及抗原呈递通路的交互作用升高，提示可能与Hashimoto病（一种自身免疫性疾病，过量产生靶向甲状腺蛋白的自身抗体）相关的替代病理生理学。与之相符的是，携带A993T或P1494L变异体的参与者抗甲状腺过氧化物酶（Anti-ThyroidPeroxidase，TPO）抗体水平升高。研究人员估计目前约有115,000名服用LT4的美国个体可受益于针对这些变异体的精准医学干预，其中约85,000人携带Q870H变异。研究结果凸显了结合大型公共生物样本库数据与分子表征以理解Tg基因型-表型关系的力量。Q870H是恢复分泌的分子疗法候选靶点，可提供超越LT4替代疗法的精准医学。

研究背景方面，Hypothyroidism是一种常见的内分泌疾病，因无法合成足够的T₃和T₄所致，当前标准治疗是使用化学合成的LT₄替代治疗，但存在剂量不当引发副作用、T₃与T₄比例失衡及血药浓度受多因素波动等问题，且病因具有异质性，包括遗传、自身免疫和环境因素。Tg作为T₃、T₄合成的前体激素，是一个330 kDa的多结构域蛋白，其基因在人类群体中存在大量遗传多样性，超过160种变异体与Hypothyroidism相关，但许多变异体临床意义不明，既往小规模队列研究统计效力有限，部分变异体如Q870H致病性判定存在冲突，因此研究人员开展此项研究，旨在利用大规模All of Us（AoU）数据库关联Tg基因型与甲状腺功能表型，识别未充分表征的致病风险变异体，并结合分子实验阐明其病理机制，为精准医学提供依据。该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》。

关键技术方法方面，研究人员使用All of Us（AoU）队列的受控层数据集v7，筛选携带特定Tg SNP变异体的参与者，分析其TSH水平（排除服用LT₄者取最近一次测量值）及LT₄使用比例作为甲状腺功能代理指标，部分分析排除男性以控制Hashimoto病性别偏倚；分子实验采用HEK293T细胞瞬时转染及Fischer大鼠甲状腺（FRT）细胞稳定表达Tg-FLAG构建体，检测分泌效率及内质网滞留（Endoglycosidase H敏感性分析）；通过原位交联亲和纯化耦合串联质量标签多重质谱（AP-MS）分析Tg变异体与蛋白稳态网络的交互组；利用Cryo-EM结构（PDB:6SCJ、7B75）进行变异位点结构映射；采用主成分分析（PCA）评估交互组相似性，并运用统计学方法（卡方检验、ANOVA、Wilcoxon检验等）进行数据分析。

研究结果部分，第一个小标题为Frequent Tg variants are linked to an increased risk of hypothyroidism，研究人员通过AoU数据库分析10种Tg变异体携带者（未服LT₄）的最近TSH水平，发现A993T、P1494L、R320C、Q870H、R152H等中位TSH高于L1063M，但无显著超标；分析LT₄使用比例并以10%为背景 cutoff，发现P1494L、A993T与R320C合并、Q870H、R152H关联LT₄使用概率显著增加，LT₄使用与TSH水平相关系数达0.8952；结合等位基因频率估算美国约有115,000名服LT₄者可受益于精准医学，其中Q870H约85,000人；AlphaMissense评分显示Q870H、R152H为模糊区间，A993T、P1494L预测为良性，与表型无清晰相关性，表明计算预测无法完全替代大队列关联分析。第二个小标题为Structure-mapping finds high-risk Tg variants at residues promoting molecular interactions，研究人员将变异映射至Tg Cryo-EM结构，变异分布于不同结构域（Tg重复域、胆碱酯酶样（ChEL）域、臂域、核心域等），R152形成盐桥与阳离子-π作用，R320C引入半胱氨酸可能影响邻近C301-C319二硫键，A993T位于二聚体界面疏水口袋，P1494L位于臂域环区可能贡献熵稳定性，Q870（PDB:7B75）与Q780形成氢键；而功能影响小的L1063M位于柔性区与F383有范德华作用，D1767del位于柔性区无显著相互作用，提示高风险变异多位于参与分子互作的残基。第三个小标题为Disease-Associated Tg Variants Show Secretion Defects，研究人员在HEK293T细胞检测Tg-FLAG分泌效率（培养基/裂解液比值），发现R152H、R320C、Q870H分泌显著降低，A993T、P1494L轻度降低但不显著；在FRT细胞中验证，上述三个缺陷变异仍显著降低，P1494L在FRT中亦呈降低趋势（p=0.0625）；EndoH敏感性分析显示R152F、R320C、P1494L、A993T部分Tg滞留内质网；FRT定量蛋白质组显示ATF6分支靶蛋白（HSPA5、HSP90B1等）在变异体中上调；分泌效率与参与者TSH水平相关系数r²=0.6978，与LT₄使用率相关但A993T、P1494L为离群点，提示其可能有非分泌缺陷机制。第四个小标题为The Secretion Defect of Disease-associated Tg Variants Can be Attributed to Altered Proteostasis Interactions，研究人员通过AP-MS分析FRT细胞中Tg变异体互作组，经k-means聚类为5簇，簇1（富集于R152H、R320C、C1264R）主要为内质网蛋白稳态因子（钙连蛋白Calr、钙网蛋白Canx、蛋白二硫键异构酶Pdia3/4/6、HSP70/90等），与分泌缺陷相关；簇4（A993T、P1494L、C1264R）含翻译相关蛋白；簇5（A993T）富集泛素蛋白酶体系统与内质网蛋白稳态因子；PCA显示Q870H互作组最接近野生型（WT），C1264R偏离最大，R152H、R320C沿PC1正方向偏离（负荷为折叠伴侣），A993T、P1494L沿PC2负方向偏离（负荷为自噬Fnbp1l、ERAD Ubxn4等），表明分泌缺陷源于蛋白稳态交互改变。第五个小标题为A993T and P1494L Variants Show Interactions with Factors that Link to Hashimoto’s Disease，研究人员发现A993T特异性互作因子Fnbp1l（参与异噬及MHC-II呈递）、DNAJB1（溶酶体降解）、Bag6与Ubxn4（泛素蛋白酶体系统肽生成供MHC加载）等；返回AoU数据库分析女性参与者抗TPO抗体水平，将PCA象限变异合并分析，发现A993T与P1494L合并组抗TPO抗体显著升高，其他组（如R152H+R320C、L1063M+D1767del）无显著升高，提示这两变异交互组重塑可能易致Hashimoto病。

讨论部分总结，研究人员表明AoU大队列可用于识别普遍Tg变异体并评估其对Hypothyroidism的贡献，解决如Q870H致病性冲突及疾病易感性差异问题，可优先表征未充分研究变异体；分子表征显示分泌效率降低是多数致病变异特征，与Tg错误折叠导致内质网滞留的病理一致，但A993T分泌接近WT却功能受损，其互作组显示降解与抗原呈递因子交互升高，AoU数据显示其携带者抗TPO抗体升高，提示A993T、P1494L可能通过异常加工产生自身抗原诱发Hashimoto病，连接蛋白稳态紊乱与自身免疫病原发因素；局限包括未分析纯合子、未考虑其他共存变异、细胞模型无法完全模拟甲状腺微环境、Hashimoto病机制尚需动物模型与大队列验证；该生物样本库驱动框架可拓展至其他疾病的基因型-表型研究，Q870H因影响人群大、部分转运能力保留及蛋白稳态干扰有限，是药理伴侣（小分子稳定错误折叠蛋白）恢复分泌的潜力靶点，可恢复下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴自我调节，优于单纯LT₄替代。研究结论翻译为：我们在此展示了大型生物医学队列研究枢纽All of Us（AoU）在识别普遍Tg变异体及评估其对Hypothyroidism贡献方面的效用。AoU允许研究具有冲突解释的变异体，如Q870H变异体，该变异体在Hyperthyroidism、Hypothyroidism和非地方性甲状腺肿患者中发现。这也能检测疾病易感性的差异，因为我们发现变异体显示不同程度的甲状腺功能和LT₄使用。本研究中强调的变异体已在Hypothyroidism患者中检测到，但分子表征有限。因此，未来使用AoU可能有助于优先表征变异体。为研究Tg突变的分子后果，研究人员首先检测了分泌效率，这是许多致病变异体中发现的降低的特征。该指标与大多数突变相关，与先前发现一致，即Tg错误折叠代表变异体相关Hypothyroidism风险的常见致病机制。值得注意的是，尽管A993T导致甲状腺功能降低，但其分泌效率与WT相似。这促使进一步研究可能导致分泌减少或非分泌缺陷的蛋白质量控制缺陷的蛋白稳态网络交互。所有致病突变均表现出与WT不同的交互组。交互模式的详细分析显示R152H和R320C与先前建立的内质网蛋白稳态因子（包括凝集素伴侣、PDIs和热休克蛋白）交互，与折叠缺陷导致分泌缺陷的原因一致。相比之下，A993T和P1494L变异体与蛋白稳态网络的交互进一步分化。特别是，A993T与其他变异体分开聚类，并表现出与蛋白降解和抗原呈递相关的独特互作因子，提示不同的病因。细胞通过蛋白酶体和溶酶体途径的蛋白降解产生肽用于加载到MHC分子上进行细胞表面呈递和免疫识别。交互组分析显示这些降解过程中的几种蛋白（Fnbpl1、Dnajb1、Bag6和Ubxn4）与A993T变异体特异性交互。这种改变的交互谱表明A993T可能经历异常加工，可能产生新型自身抗原引发Hashimoto病。AoU数据库使得进一步研究这种潜在疾病关联成为可能，再次凸显了大规模生物医学数据集的实用性和多功能性。使用抗TPO抗体作为Hashimoto病易感性的诊断替代指标，发现特定蛋白稳态网络交互的变化与抗体水平相关。先前报道将其他Tg变异体（R2510Q、S734A和M1027V）与Hashimoto病风险增加联系起来，使这些变异体成为未来交互组研究的有前景候选。此外，内质网应激被假设为Hashimoto发病机制起始因素，突出了与蛋白稳态破坏的进一步联系。虽然Hashimoto病主要表征为免疫系统疾病，但此处数据表明特定Tg变异体可能通过改变蛋白加工通路增加抗原呈递易感性及后续自身免疫反应而遗传促成该病。解释我们的发现应考虑若干局限。首先，我们考虑AoU中给定Tg变异体参与者数据而不考虑合子性，未考虑可能影响表型的其他变异体，未分析感兴趣变异体的纯合子参与者。第二，虽然我们检查了几个与甲状腺功能相关的Tg指标，但甲状腺功能障碍是可能由多种贡献因素导致的复杂状况，因此即使存在这些变异体，甲状腺生物学其他方面可能在病因中起重要作用。第三，基于细胞的模型是对复杂甲状腺微环境的粗略表示。未来研究将受益于动物模型以验证与甲状腺功能降低相关的识别变异体的功能后果。最后，尽管我们发现A993T和P1494L变异体与Hashimoto病的可能联系，但潜在致病机制尚不清楚。检查变异体特异性肽呈递的机制研究、富集这些变异体的更大队列及靶向研究可提供更佳分辨率以确定各变异体发展Hashimoto病的相对疾病风险。总体而言，用于识别感兴趣功能相关遗传变异体的生物样本库驱动方法代表了适用于其他对人类健康重要的疾病相关蛋白和生物通路的 scalable 框架。像AoU这样的大规模生物医学数据存储库可用于描绘具有异质病因的疾病，从而识别可优化患者特异性治疗的精准医学方法。我们的发现说明了这种病因多样性：错误折叠倾向的Tg变异体可能需要与易患自身免疫性甲状腺炎变异体不同的治疗策略。在本文表征的变异体中，Q870H成为最有希望的靶向候选。这种错误折叠变异体影响美国大量人群，同时保留部分转运能力并显示蛋白稳态网络交互的有限破坏。这些特征表明Q870H相关Tg错误折叠可能适合通过药理伴侣（结合并稳定错误折叠蛋白的小分子）纠正。这种治疗方法在其他蛋白错误折叠疾病（特别是囊性纤维化）中显示成功。错误折叠Tg的成功药理伴侣救援可恢复Q870H携带者的正常HPT功能，可能改善生活质量并为尽管标准LT₄替代治疗仍有持续症状的患者提供替代治疗选择。