《Journal of Biological Chemistry》：TIP60 promotes chemoresistance by limiting intracellular platinum accumulation and enhancing removal of cisplatin-DNA adducts
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顺铂耐药是有效治疗鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）的主要障碍，包括皮肤SCC和头颈部SCC，其中超过一半的晚期病例出现耐药。研究人员先前的研究表明，遗传敲低或药理学抑制TIP60（KAT5）（一种组蛋白乙酰转移酶）可使顺铂
顺铂耐药是有效治疗鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）的主要障碍，包括皮肤SCC和头颈部SCC，其中超过一半的晚期病例出现耐药。研究人员先前的研究表明，遗传敲低或药理学抑制TIP60（KAT5）（一种组蛋白乙酰转移酶）可使顺铂耐药的SCC细胞增敏，诱导细胞周期阻滞并促进细胞死亡，提示TIP60在介导耐药中发挥关键作用。在本研究中，研究人员使用顺铂敏感和耐药的SCC细胞系，结合siRNA介导的基因沉默、稳定过表达、药理学抑制、免疫斑点法和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS），证明TIP60通过两条互补途径促进耐药：（1）上调外排转运体ABCC1，减少细胞内顺铂积累；（2）增加XPC表达，XPC是核苷酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）途径的关键组分，参与顺铂-DNA加合物的识别和去除。升高的TIP60水平与耐药细胞系中顺铂-DNA加合物水平降低、顺铂-DNA加合物去除增强以及细胞存活率增加相关。TIP60缺失降低ABCC1表达并增加顺铂-DNA加合物水平，ABCC1抑制剂MK-571也观察到类似效果。同时，TIP60敲低损害顺铂-DNA加合物的去除，并降低多个DNA损伤应答（DNA damage response, DDR）基因的表达，包括XPC。联合抑制TIP60与螺内酯（靶向XPB/NER）或MK-571进一步降低耐药细胞存活并增加细胞死亡。这些发现确立了TIP60作为整合药物外排和DNA修复途径的顺铂耐药调节因子，突出表明抑制TIP60是克服SCC铂耐药的有前景治疗策略。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
顺铂（cisplatin）是治疗多种实体瘤的经典化疗药物，通过形成铂-DNA加合物诱导DNA损伤。然而，超过半数晚期皮肤鳞状细胞癌（cutaneous SCC, cSCC）和头颈部鳞状细胞癌（head and neck SCC, HNSCC）患者会发展出获得性耐药，导致治疗失败。耐药机制复杂，包括药物外排增加、DNA损伤修复增强、凋亡信号改变等。既往研究提示，乙酰转移酶TIP60（KAT5）在DNA损伤应答和染色质重塑中发挥核心作用，其高表达与鳞状细胞癌（SCC）的顺铂耐药相关。然而，TIP60是否通过同时调控药物外排和DNA修复两条途径来促进耐药，尚不清楚。本研究旨在阐明TIP60介导顺铂耐药的具体分子机制，为开发靶向治疗策略提供依据。该论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。
**研究开展与结论**
研究人员利用顺铂敏感和耐药的SCC细胞系（包括A431皮肤SCC亲代及获得性耐药细胞A431 Pt，以及头颈部SCC细胞系JHU029和JHU006），结合siRNA敲低、稳定过表达、药理学抑制剂（TH1834抑制TIP60，MK-571抑制ABCC1，螺内酯降解XPB），通过免疫斑点法检测1,2-d(GpG)顺铂-DNA加合物、ICP-MS定量细胞内铂和DNA结合铂、qRT-PCR和免疫印迹分析基因表达、细胞存活和软琼脂集落形成实验，以及细胞热转变分析（CETSA）验证药物靶点结合，系统解析了TIP60的作用。结论：TIP60通过上调ABCC1介导的顺铂外排和增强XPC依赖的核苷酸切除修复（NER）两条互补途径，促进SCC细胞对顺铂的耐药性。药理学抑制TIP60可同时削弱这两条途径，有效增敏耐药细胞，提示TIP60是克服铂耐药的有前景治疗靶点。
**主要关键技术方法**（不超过250字）
本研究使用A431皮肤SCC亲代和获得性耐药细胞系（A431 Pt，来自Paola Perego实验室），以及头颈部SCC细胞系JHU006（自然耐药）和JHU029（敏感，来自James W Rocco实验室）。主要技术包括：免疫斑点法（immuno-dot blot）检测1,2-d(GpG)顺铂-DNA加合物；ICP-MS定量细胞内铂和DNA结合铂；siRNA介导的基因沉默（靶向TIP60、ABCC1、XPC、p63）；稳定过表达（慢病毒介导的Flag-TIP60或eGFP）；药理学抑制（TH1834抑制TIP60，MK-571抑制ABCC1，螺内酯降解XPB）；qRT-PCR和免疫印迹分析基因表达；细胞存活（2D集落形成）和软琼脂3D集落形成实验；CETSA验证TH1834与TIP60的结合。
**研究结果**
**1. Cisplatin resistant cells exhibit reduced levels of cisplatin-DNA adducts compared to parental cells.**
通过免疫斑点法，用特异性识别1,2-d(GpG)顺铂-DNA加合物的抗体检测，发现耐药细胞（A431 Pt和JHU006）在顺铂脉冲处理后，加合物水平显著低于对应敏感细胞（A431亲代和JHU029），表明耐药与加合物积累减少相关。
**2. TIP60 knockdown increases 1,2-d(GpG) cisplatin-DNA adduct levels.**
在耐药细胞中敲低TIP60后，立即检测加合物水平，发现加合物显著增加；相反，在敏感细胞中稳定过表达TIP60则降低加合物水平。ICP-MS验证TH1834处理也增加总铂-DNA加合物。表明TIP60限制加合物形成。
**3. ABCC1 is overexpressed and correlates with TIP60 levels in cisplatin resistant cells.**
qRT-PCR和免疫印迹显示，耐药细胞中ABCC1的mRNA和蛋白水平显著高于敏感细胞，且与TIP60水平正相关。
**4. ABCC1 expression is regulated by the ΔNp63α/TIP60 axis and inhibited by TH1834.**
敲低ΔNp63α或TIP60均降低ABCC1表达；TIP60过表达增加ABCC1；3'UTR siRNA rescue实验证实ABCC1依赖TIP60。TH1834（TIP60抑制剂）处理降低ABCC1转录和蛋白水平。CETSA证实TH1834与TIP60直接结合。
**5. ABCC1 contributes to reduced 1,2-d(GpG) cisplatin-DNA adduct levels in resistant cells.**
用ABCC1抑制剂MK-571预处理耐药细胞，顺铂脉冲后加合物水平显著升高，siABCC1也呈类似趋势，表明ABCC1外排导致加合物减少。
**6. Pharmacological inhibition of TIP60 increases 1,2-d(GpG) cisplatin-DNA adduct levels.**
顺铂脉冲后给予TH1834处理24小时，耐药细胞中残留加合物水平显著高于仅顺铂处理组，提示TIP60活性促进加合物去除。
**7. TIP60 inhibition reduces survival of cisplatin-resistant cells.**
TIP60敲低或TH1834处理均降低顺铂处理后耐药细胞的存活率，联合处理效果更显著。软琼脂集落形成实验也证实联合治疗减少集落数。
**8. Cisplatin resistant cells exhibit enhanced removal of 1,2-d(GpG) cisplatin-DNA adducts.**
脉冲后不同时间点检测加合物，耐药细胞去除加合物的速率显著快于敏感细胞，表明其修复能力增强。
**9. Pharmacological inhibition of TIP60 impairs removal of 1,2-d(GpG) cisplatin-DNA adducts.**
TH1834处理延缓耐药细胞中加合物的清除，证实TIP60活性对加合物去除至关重要。
**10. TIP60 regulates DNA damage responsive gene expression in cisplatin resistant cells.**
通过qRT-PCR筛选60个DDR基因，发现耐药细胞中ATM、CHEK2、ERCC1、FANCD2、GADD45A、RAD50等上调；TIP60敲低或TH1834处理降低这些基因表达，表明TIP60正向调控DDR基因网络。
**11. TIP60 and ΔNp63α regulate XPC expression and NER-associated removal of 1,2-d(GpG) cisplatin-DNA adducts in cisplatin-resistant cells.**
耐药细胞中XPC转录和蛋白水平升高；敲低TIP60或ΔNp63α降低XPC表达；TIP60过表达增加XPC；3'UTR rescue实验证实XPC依赖TIP60。用螺内酯降解XPB（NER必需解旋酶）后，顺铂加合物水平升高，支持NER在加合物去除中的作用。
**12. TH1834 treatment reduces survival and enhances cell death in cisplatin-resistant cells lacking ABCC1.**
在ABCC1敲低或MK-571处理的细胞中，联合TH1834进一步降低存活率并增加PARP切割（凋亡标志），表明TIP60抑制与ABCC1阻断协同增强细胞死亡。
**13. Inhibition of both TIP60 and NER associated repair functions increases cell death in cisplatin resistant cells.**
XPC敲低或螺内酯处理与TH1834联合，进一步降低存活并促进PARP切割，表明同时靶向TIP60和NER途径可有效杀死耐药细胞。
**总结讨论部分与结论翻译**
讨论部分指出，TIP60通过上调ABCC1减少细胞内顺铂积累，并通过转录上调XPC增强NER介导的加合物去除，两条互补途径共同驱动SCC细胞的顺铂耐药。此外，TIP60还调节其他DDR基因（如ATM、RAD50、FANCD2），可能参与同源重组和范可尼贫血修复途径。从转化角度，TIP60抑制剂（如TH1834）在动物模型中已显示疗效，联合顺铂或放疗有望克服耐药。研究结论翻译如下：“总之，本研究提供了令人信服的证据，表明TIP60通过其双重功能——通过ABCC1调节药物外排和通过XPC促进NER相关的顺铂-DNA加合物去除——成为SCC细胞中顺铂耐药的关键介导因子。……靶向TIP60/ΔNp63α轴可能成为克服铂耐药并改善铂耐药SCC患者预后的新策略。”
