《Journal of Biological Chemistry》：Macrocyclic and linear peptides promote LAR dimerization and neurite outgrowth
编辑推荐：
白细胞常见抗原相关蛋白（Leucocyte common antigen-related protein, LAR）属于IIa型受体蛋白酪氨酸磷酸酶（receptor protein tyrosine phosphatase, RPTP）亚家族，通过其磷酸酶活
白细胞常见抗原相关蛋白（Leucocyte common antigen-related protein, LAR）属于IIa型受体蛋白酪氨酸磷酸酶（receptor protein tyrosine phosphatase, RPTP）亚家族，通过其磷酸酶活性或细胞间相互作用调控细胞分化、迁移、轴突延长及轴突再生等生物学过程。LAR的磷酸酶活性受其胞外或胞质分子相互作用驱动的二聚化负调控。在神经系统中，单体LAR抑制轴突延长与再生，而二聚或寡聚LAR表现出相反效应。然而，由于缺乏随意调控LAR二聚化的工具，与LAR二聚化相关的细胞内信号机制仍不完全清楚。本研究研究人员采用随机非标准肽集成发现（random non-standard peptides integrated discovery, RaPID）系统进行肽库筛选，该系统结合mRNA展示与遗传密码重编程。通过此方法，研究人员鉴定出高亲和力的LAR结合大环肽与线性肽，分别命名为L6与D1L。在分裂荧光素酶实验中，这些肽以最小的脱靶效应促进小鼠与人LAR的二聚化。当使用交联剂将L6或D1L二聚化后，两种肽均显示出增强的LAR二聚化活性，其中源自D1L的二聚体表现出最强效应。此外，单体与二聚体肽均促进培养海马神经元中的神经突生长。结果表明，这些从头设计的肽是LAR二聚化的选择性调节剂，为探究LAR介导的轴突生长与再生信号提供了新的工具。
该研究针对LAR（Leucocyte common antigen-related protein）二聚化状态调控其磷酸酶活性及轴突生长作用的机制不明、缺乏特异性调控工具的现状，开展LAR结合肽的发现与功能研究，旨在获得能选择性调控LAR聚类状态的新工具并阐明其二聚化与神经突生长的关联。研究人员利用RaPID（random non-standard peptides integrated discovery）系统筛选获得高亲和力大环肽L6与线性肽D1L，证实二者可促进小鼠及人LAR二聚化且脱靶效应极小，其交联二聚体进一步增强该活性，且单体与二聚体均能促进原代海马神经元神经突生长，并伴随Erk（extracellular signal-regulated kinase）信号激活。该研究为解析LAR不同聚合形式在轴突生长与再生中的细胞内信号机制提供了选择性调节工具，具重要理论与潜在治疗意义，论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。
研究人员主要采用以下关键技术方法：利用RaPID系统结合mRNA展示与遗传密码重编程进行肽库筛选；通过表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）测定肽与LAR Ig样域的结合动力学；采用基于NanoLuc Binary Technology（NanoBiT）的分裂荧光素酶互补实验在活细胞中检测LAR二聚化；化学合成单体及PEG交联二聚体肽；原代海马神经元培养（来源为Fezf2-EGFP或Fezf2-tdTomato小鼠胚胎E18.5）并进行神经突长度定量；在N2A细胞中过表达LAR后经肽处理，通过蛋白质印迹分析Akt、Erk1/2磷酸化及RhoA pull-down检测活性RhoA；利用ColabFold、HADDOCK与Rosetta进行LAR-肽复合物结构预测。
研究结果
Identification of macrocyclic peptides against LAR Ig domains：研究人员经RaPID系统八轮筛选获得11条靶向小鼠LAR Ig样域的肽，SPR分析显示其与mLAR-Ig的KD值为1.8–380 nM，其中大环肽L6（KD=1.8 nM）与线性肽D1L（KD=5.9 nM）亲和力最高。
Macrocyclic and linear peptides dimerized mLAR in HEK293T cells：通过分裂荧光素酶实验，研究人员发现L6、L8、D1L与D1LTr能显著促进HEK293T细胞中mLAR二聚化，而其余测试肽无此效应，且L6与D1L的二聚化能力与SPR测得的结合亲和力一致。
L6 and D1L dimerized both mLAR and hLAR：研究人员证实L6、L8、D1L与D1LTr可促进人LAR（hLAR）二聚化且效应与小鼠相似；L6以微外显子meA与meB非依赖方式二聚化所有mLAR剪接变体，而D1L仅促进含meA的mLAR变体二聚化；二者均不促进小鼠PTPδ与PTPσ二聚化，L6不影响FGFR1与SynCAM1，D1L对其有微弱共价介导的抑制，未见明显细胞毒性与肽聚集。
Dimeric L6 and D1L promoted LAR dimerization：研究人员合成PEG1/5/11交联的L6与D1L二聚体，发现在低浓度下二聚体较单体增强LAR二聚化活性，其中D1L-PEG1增强最为显著，但高浓度下活性趋于平台，L6二聚体增强效果受连接子长度影响且较温和。
Neurite elongation was enhanced by monomeric and dimeric peptides in cultured hippocampal neurons：研究人员在原代海马神经元中发现D1L与D1L-PEG1呈浓度依赖性促进神经突伸长，L6在较宽浓度范围促进但非严格浓度依赖，D1无效应，联合应用L6与D1L-PEG1未超越单一肽效应。
L6 activated Erk signaling in N2A cells：研究人员在LAR转染的N2A细胞中用10 μM L6处理，发现120分钟时Erk1/2磷酸化显著升高约1.7倍，活性RhoA在60分钟有轻度非显著增加，Akt磷酸化无明显变化，表明L6促LAR二聚化关联MAPK/Erk通路激活。
讨论部分总结：研究人员指出LAR单体抑制、二聚/寡聚促进轴突生长，但缺乏选择性调控工具限制机制解析；RaPID所获肽尤其L6与D1L具有高亲和力与特异性，可跨种属促进LAR二聚化并区分剪接变体，D1L依赖meA结合而L6结合Ig域具广谱性；二聚体肽通过亲合力提升活性，D1L衍生物体更强；肽促神经突伸长幅度有限，可能与LAR寡聚化程度不足、神经元中剪接变体异质性及L6潜在多结合位点有关；L6激活Erk信号与既往LAR-CSPG交互抑制该通路的报道一致；现有LAR调节剂多靶向胞内区，L6等靶向胞外Ig域的大环肽具化学合成可控与还原稳定优势，但体内应用面临血清稳定性、递送与血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）穿透挑战；需进一步优化药代与递送性质并开展体内评价。
研究结论部分翻译：LAR在细胞骨架组织、细胞分化、黏附、迁移、轴突生长与再生神经突生长等生物学过程的信号转导中发挥重要作用。LAR的磷酸酶活性受包括寡聚化与配体结合在内的多种机制调控。神经系统中单体LAR被认为表现磷酸酶活性并抑制轴突生长与再生，而二聚或寡聚LAR具相反效应。然而，由于缺乏对LAR寡聚化状态选择性控制的工具，这些形式如何调控与轴突生长及神经再生相关的细胞内信号仍待阐明。本研究中，研究人员利用RaPID系统鉴定出由14–26个氨基酸组成的结合mLAR-Ig的肽。本研究关注的大环肽L6与线性肽D1L对小鼠及人LAR-Ig具高亲和力并增强LAR二聚化。此外，L6与D1L促进培养海马神经元中的神经突生长。这些结果表明，L6与D1L可用于通过控制其寡聚化状态来探究单体、二聚或寡聚LAR如何调控生物学过程。
