《Journal of Biological Chemistry》：β-arrestin and myosin VI cooperatively control glucose-dependent insulinotropic peptide receptor (GIPR) internalization and signaling dynamics
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葡萄糖依赖性胰岛素样肽受体（GIPR）刺激胰岛素释放并调节代谢稳态。GIPR的功能由该G蛋白偶联受体（GPCR）的时空运输塑造。虽然GPCR内吞传统上与β-arrestin相关，但GIPR内化仅适度依赖该途径。在本研究中，研究人员证明GIPR招募一种细胞骨架马
葡萄糖依赖性胰岛素样肽受体（GIPR）刺激胰岛素释放并调节代谢稳态。GIPR的功能由该G蛋白偶联受体（GPCR）的时空运输塑造。虽然GPCR内吞传统上与β-arrestin相关，但GIPR内化仅适度依赖该途径。在本研究中，研究人员证明GIPR招募一种细胞骨架马达myosin VI来驱动受体内化。GIPR通过其C末端的PDZ结合基序（PBM）与接头-马达复合物结合。有趣的是，β-arrestin与PBM上游磷酸化残基的结合增强了myosin VI的招募和激活。GIPR内化分别依赖于受体磷酸化和PBM位点来招募β-arrestin和myosin VI。β-arrestin和myosin VI的协同作用导致GIP刺激的cAMP（环磷酸腺苷）信号脱敏，同时激活内体区室的pERK1/2（磷酸化细胞外信号调节激酶1/2）。阻断myosin VI活性增强胰腺β细胞的胰岛素释放，表明该途径在调节GIPR生理效应中的新作用。研究人员的发现突出了两个独立运输途径在受体C-tail水平的直接汇聚，对通过β-arrestin和myosin VI的差异化参与来精细调控单个GPCR具有重要意义。
**论文解读：β-arrestin与myosin VI协同调控GIPR内化与信号动力学**
**研究背景与问题**
G蛋白偶联受体（GPCR）的内化是受体脱敏、区室化信号及生理反应时空调控的关键机制。传统上，clathrin依赖的GPCR内吞通过β-arrestin与GPCR C-tail上GRK磷酸化残基的招募进行。与此同时，约30%的GPCR C-tail含有PDZ结合基序（PBM），可招募PDZ适配蛋白以促进受体运输。这两种途径对GPCR内化的相对影响取决于受体C-tail的特定序列基序。然而，这两种途径在同一个受体中如何交汇以调控信号和生理反应尚不清楚。葡萄糖依赖性胰岛素样肽受体（GIPR）是一种B类GPCR，调节葡萄糖代谢、体重、骨形成和食物摄入，其差异化脱敏对代谢紊乱的靶向治疗具有重要意义。GIPR与GLP1R共同负责餐后胰岛β细胞胰岛素分泌的增加（即肠促胰岛素效应），该效应在2型糖尿病（T2D）中受损。GIPR的慢性激动导致cAMP信号脱敏，而GIPR与GLP1R的共激动在减重方面优于GLP1R单激动，这些矛盾结果凸显了对GIPR功能与调控认知的不足。GIPR具有较长的C-tail，包含多个磷酸化位点以招募β-arrestin，以及一个推定的PBM。研究人员先前证明GPCR可通过PBM位点招募myosin VI。因此，本研究旨在阐明β-arrestin与myosin VI两种运输途径在GIPR中的交汇机制。
**研究内容与结论**
研究人员通过使用myosin VI选择性抑制剂（TIP）和β-arrestin双敲除细胞系（Δβ-arr），在HEK293细胞和INS-1 832/3大鼠胰岛素瘤细胞中，结合免疫荧光、活细胞成像、cAMP检测、pERK检测、体外FRET及肌动蛋白滑动实验，系统研究了GIPR内化、信号转导及胰岛素分泌的调控机制。研究发现，GIPR内化共同依赖于β-arrestin和myosin VI；β-arrestin通过增强GIPC（myosin VI的PDZ适配蛋白）与GIPR C-tail的结合来促进myosin VI活性；阻断myosin VI活性导致GIPR在质膜滞留，增强cAMP信号而减少内体pERK1/2激活，并在胰腺β细胞中促进胰岛素分泌。这表明β-arrestin与myosin VI在GIPR C-tail水平直接汇聚，协同调控受体内化与信号动力学，对理解肠促胰岛素受体生理及代谢疾病治疗具有重要意义。该论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。
**关键技术与方法概述**
主要技术方法包括：1）使用HEK293野生型（WT）和β-arrestin 1/2敲除（Δβ-arr）细胞系以及INS-1 832/3大鼠胰岛素瘤细胞系进行细胞培养与处理；2）通过FLAG标记的GIPR进行免疫荧光内化实验和活细胞成像；3）利用cAMP Glo assay和HTRF检测cAMP水平与pERK1/2信号；4）采用双分子FRET（荧光共振能量转移）检测GIPC与GIPR C-tail及β-arrestin的相互作用；5）基于肌动蛋白滑动运动的体外运动性实验测定myosin VI活性；6）葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验检测胰岛素释放。
**研究结果**
**GIPR internalization requires both β-arrestin and myosin VI**
通过免疫荧光和活细胞成像发现，在HEK293细胞中，GIP（1 μM，15 min）刺激显著促进GIPR内化。β-arrestin敲除（Δβ-arr）或myosin VI抑制剂TIP（100 μM）预处理均显著减少内化，而两者联合处理无叠加效应，表明GIPR内化需要β-arrestin和myosin VI的共同参与。
**GIP-stimulated internalization has been shown to result in reduced cAMP signaling**
在HEK293 WT和Δβ-arr细胞中，TIP（10 μM）处理显著增强GIP刺激的cAMP积累，提示阻断myosin VI依赖的内化可减弱cAMP信号脱敏。同时，TIP处理显著降低pERK1/2水平，表明MAPK活性主要来自内化后的受体。
**GIPC is recruited to GIPR prior to agonist treatment**
GIPC（myosin VI的PDZ适配蛋白）与GIPR在质膜上共定位，且不依赖于GIP刺激、β-arrestin或myosin VI活性。而β-arrestin仅于GIP刺激后才被招募至GIPR内体。此外，GIPR共表达导致β-arrestin发生核转位，该现象为GIPR特异性。
**β-arrestin and GIPC interactions with GIPR are both essential for receptor internalization**
通过构建GIPR的PBM缺失突变体（ΔPBM）和磷酸化缺陷突变体，发现两者均显著降低GIPR内化效率，但ΔPBM突变体影响更显著，进一步证实β-arrestin和GIPC相互作用对GIPR内化的必要性。
**GIPC engagement of GIPR C-tail is enhanced by β-arrestin**
体外FRET实验显示，GIPC与GIPR C-tail（磷酸化模拟或磷酸化缺陷）均有结合，而加入重组β-arrestin可增强GIPC与磷酸化模拟C-tail的相互作用。肌动蛋白滑动实验表明，β-arrestin进一步提高了由GIPC和GIPR C-tail刺激的myosin VI运动速度，证实β-arrestin增强GIPC对GIPR C-tail的招募及myosin VI活性。
**Myosin VI mediates insulin secretion at GIPR**
在INS-1 832/3细胞中，TIP（10 μM）处理显著增强GIP刺激下的cAMP释放和高葡萄糖条件下的胰岛素分泌，表明myosin VI活性在GIPR介导的胰岛素分泌中起脱敏作用。
**总结与讨论**
本研究揭示了GIPR内化由β-arrestin和myosin VI两条途径协同调控的机制。GIPC（myosin VI的适配蛋白）在激动剂刺激前即与GIPR结合，而β-arrestin仅在激动剂刺激后招募，进一步稳定GIPC-GIPR相互作用并激活myosin VI，驱动受体内化。这一协同作用导致质膜cAMP信号脱敏，同时促进内体pERK1/2信号。在生理水平上，myosin VI活性通过限制胰岛素分泌发挥负调控作用。研究结论表明，β-arrestin和myosin VI在GIPR C-tail水平直接汇聚，通过差异化参与精细调控单个GPCR的运输与信号，为理解肠促胰岛素受体功能及代谢疾病治疗提供了新视角。
