《Canadian Journal of Plant Science》：Successful gene editing in tetraploid alfalfa using the open-source, AI-derived OpenCRISPR-1
编辑推荐：
尽管基于CRISPR/Cas的基因编辑技术有潜力极大推进作物育种工作，但知识产权相关问题可能阻碍此类品种进入市场。近期，一种源自大语言模型（large language models）的开源Cas核酸酶（OpenCRISPR-1）被开发出来，并被证实在huma
尽管基于CRISPR/Cas的基因编辑技术有潜力极大推进作物育种工作，但知识产权相关问题可能阻碍此类品种进入市场。近期，一种源自大语言模型（large language models）的开源Cas核酸酶（OpenCRISPR-1）被开发出来，并被证实在human细胞和水稻中有效。在本研究中，研究人员展示了该核酸酶在多倍体植物物种紫花苜蓿（Medicago sativa）中的应用，在携带OpenCRISPR-1的基因型中观察到30%发生单等位基因或双等位基因编辑。这些发现表明，OpenCRISPR-1有望扩展基因编辑技术在多倍体作物育种中的使用。
研究背景与意义
目前，CRISPR/Cas平台在过去十年中被广泛用于在特定基因组位点诱导突变，其中基于化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9核酸酶（SpCas9）的系统在植物中最常用，可实现靶基因破坏、基因或等位基因替换、碱基编辑、引导编辑及表观遗传改变等。在许多情况下，CRISPR/Cas诱导的突变与自发突变或常规育种产生的突变无法区分，因此大多数国家判定此类编辑衍生的作物不会面临转基因作物所需的严格、漫长且成本高昂的监管政策。然而，将标准Cas基技术用于作物育种受到复杂的知识产权（IP）格局的严重阻碍，通常涉及多个实体、长期争议及各国专利持有者的不一致。因此，迫切需要开发无此类限制的新型核酸酶用于基因编辑。与此相符，生成式AI大语言模型近期被用于设计一种新型Cas核酸酶OpenCRISPR-1，其与SpCas9存在超过400个核苷酸差异，与其最接近的自然同源物存在超过180个差异，对应氨基酸同一性不超过86.3%，且不受相关专利覆盖。与其他Cas酶不同，该核酸酶已被开放获取用于研究和商业目的，这对促进CRISPR/Cas基因编辑作为育种工具的使用具有重要意义。虽然OpenCRISPR-1已在human细胞中显示出与SpCas9相当的有效性，但其在植物中的应用才刚刚兴起，目前尚无关于其在多倍体或双子叶植物物种中功效的报道，而这两类物种占作物的很大比例。因此，研究人员旨在评估其在重要四倍体饲料豆科作物紫花苜蓿（Medicago sativa L.）的测试位点植物蓝铜蛋白4（PLANTACYANIN4；MsPLC4）诱导突变的能力，以验证这一潜在变革性编辑工具纳入作物育种工具箱的价值。该研究发表在《Canadian Journal of Plant Science》。
主要关键技术方法
研究人员以四倍体紫花苜蓿N4.2.2基因型为材料，构建基于SpCas9的正对照载体PLC4-Cas9与基于OpenCRISPR-1的实验载体PLC4-OpenCR，两者均靶向MsPLC4基因的3个向导RNA（gRNA）位点。通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404菌株介导转化紫花苜蓿，获得独立转基因基因型后提取基因组DNA验证转基因状态，采用双索引扩增子测序（dual-indexed amplicon sequencing）方法，扩增MsPLC4位点568 bp区域并进行Illumina MiSeq i100平台双端测序，使用Geneious Prime中CRISPR分析工具修剪读取并排除低百分比读取以分析突变。
研究结果
Materials and methods
研究人员将OpenCRISPR-1编码序列针对小麦（Triticum aestivum）和紫花苜蓿密码子优化，两端融合核定位信号（NLS）并合成，通过限制性克隆替换pKSE401载体中的SpCas9融合序列得到pKSE401-OpenCR载体。通过CRISPR-P 2.0软件在MsPLC4外显子1和2选择3个gRNA，利用Golden Gate克隆组装至两种载体背景并测序验证。将载体转入农杆菌LBA4404转化紫花苜蓿N4.2.2基因型，提取10个独立转化体叶片DNA，通过PCR验证转基因性质，采用双索引扩增子测序扩增568 bp区域进行第二轮索引PCR，纯化后测序并用Geneious Prime分析。
Results and discussion
研究人员在四倍体紫花苜蓿基因组中鉴定出4个MsPLC4等位基因，编码区核苷酸同一性98.4%，与蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）PLC4编码区和预测蛋白序列分别有97.3%–97.8%核苷酸同一性和100%氨基酸同一性，内含子 pairwise 同一性91.4%，引物结合位点和gRNA靶点无遗传变异。将3个gRNA插入SpCas9载体生成PLC4-Cas9，插入替换SpCas9为OpenCRISPR-1的pKSE401-OpenCR生成PLC4-OpenCR。转化紫花苜蓿后选10个独立转基因基因型分析，未转化野生型有4个MsPLC4等位基因（2个相同，2个不同）无突变；PLC4-Cas9转基因基因型80%在gRNA位点有突变，75%仅在gRNA1位点，25%在gRNA1和gRNA3位点，gRNA2无编辑；PLC4-OpenCR转基因基因型30%在gRNA1位点有靶向编辑，gRNA2无编辑。SpCas9编辑的4个基因型中，1个单等位基因突变，1个三等位基因突变，2个四等位基因突变无野生型序列，另4个突变涉及2–3个等位基因但仅检测到3个等位基因可能为大规模改变阻止扩增；OpenCRISPR-1编辑的3个基因型中，2个单等位基因突变，1个双等位基因突变。PLC4-Cas9突变均在PAM上游0–5 bp，多为1–12 bp缺失，1个有65 bp大缺失，4个有1 bp插入，1个在gRNA1位点G到A替换；PLC4-OpenCR突变为PAM上游3 bp处1–8 bp缺失，与人类细胞研究结果一致。
讨论总结与研究结论翻译
讨论部分指出，OpenCRISPR-1在紫花苜蓿的编辑效率低于SpCas9，可能与密码子优化、mRNA或蛋白稳定性、PAM兼容性或核定位有关，需更大规模研究明确核酸酶功效差异；gRNA效率差异常见于植物，可能与靶点表观遗传特征、gRNA性质或驱动gRNA表达的启动子效力有关；OpenCRISPR-1在人类细胞中对错配PAM位点活性显著低于SpCas9，但在植物中尚未评估脱靶效应。将无IP限制的基因编辑工具加入多倍体作物育种工具箱，可使更多公共和私人机构参与，提供更全面性状改良，部分可面向公共利益。
结论部分翻译：尽管近年来少数CRISPR衍生作物品种（包括γ-氨基丁酸（GABA）富集的“西西里红”番茄（Sanatech Seed）和非褐变生菜（GreenVenus））在某些国家商业化发布，但许可费用和复杂性对许多实体构成限制。在本研究中，研究人员确定开源OpenCRISPR-1平台可在四倍体双子叶植物物种中成功诱导编辑。虽然该系统在紫花苜蓿中的效率可能略低于SpCas9，但需进一步研究确认。此外，虽然在人类细胞中OpenCRISPR-1对错配PAM位点的活性显著低于SpCas9，但在植物中尚未评估可能的脱靶效应。无论如何，将该无IP基因编辑工具加入多倍体作物育种工具箱，可为更广泛的公共和私人机构打开大门，这将有助于提供比目前可用更广泛性状的改良，其中至少部分可面向公共利益。
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