《Canadian Journal of Plant Science》：Multilocus sequence analysis of blackleg soft rot pathogens in potato reveals increasing pathogenicity and biocontrol strategies
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Pectobacterium 和 Dickeya 属物种是引起马铃薯黑胫病和软腐病（blackleg and soft rot, BSR）的果胶分解革兰氏阴性病原菌。研究人员通过对2021年至2024年间加拿大西部329份患病马铃薯样本进行生物测定和多位点序列
Pectobacterium 和 Dickeya 属物种是引起马铃薯黑胫病和软腐病（blackleg and soft rot, BSR）的果胶分解革兰氏阴性病原菌。研究人员通过对2021年至2024年间加拿大西部329份患病马铃薯样本进行生物测定和多位点序列分析（multilocus sequence analysis, MLSA），揭示了 Pectobacterium 属物种多样性的增加，并确认了相对高侵染力的 Dickeya 属物种的缺失。既往研究报道加拿大西部的黑胫病和软腐病主要由 Pectobacterium atrosepticum 和 Pectobacterium carotovorum 引起。本研究中更频繁地观察到额外相对致病的 Pectobacterium polaris、Pectobacterium parmentieri 以及最近出现的 Pectobacterium brasiliense 的回收。快速扩张的马铃薯产业增加了区域间的种薯流动，环境条件也促进了黑胫病的发生率、多样性及其影响。尽管发芽期的低温通常会增加黑胫病发生率，但高致病性 Pectobacterium 物种的出现即使在相对干燥和温暖的条件下也能产生黑胫病。从田间样本中分离和表征黑胫病病原体内生裂解性噬菌体（lytic bacteriophage），鉴定出属于 Siphoviridae 科的成员。噬菌体（phage）生物测定使 P. brasiliense 的疾病严重度降低了 >90%，提供了一种环保的生物防治处理方法来提高马铃薯产量和质量。应用综合病原体管理（integrated pathogen management, IPM）策略将最大限度减少与病原体多样性增加、产业扩张及气候挑战相关的病害损失。
《Canadian Journal of Plant Science》刊发的这项研究的背景在于，马铃薯是加拿大最重要的蔬菜作物之一，而黑胫病和软腐病（blackleg and soft rot, BSR）作为主要的种传细菌性病害，由果胶分解革兰氏阴性菌 Pectobacterium 和 Dickeya 属引起，严重影响产量与质量。以往加拿大西部地区的病原组成相对单一，主要以 Pectobacterium atrosepticum 和 Pectobacterium carotovorum 为主，但随着马铃薯产业跨区种薯调运的增加以及气候环境的变化，病害的流行病学特征可能发生演变。目前存在的主要问题是缺乏对该区域近期病原种群多样性、致病力变化及新兴高致病菌株分布的系统性评估，同时亟需开发应对病原体演化的环境友好型防控策略。为此，研究人员开展了2021至2024年加拿大西部马铃薯BSR病害的病原监测、分子鉴定及噬菌体生物防治潜力研究，旨在明确病原组成变迁并探索基于噬菌体的生物防治手段，其结论指出该地区 Pectobacterium 多样性显著上升且出现了高致病的 Pectobacterium brasiliense，但未见 Dickeya 属，分离的 Siphoviridae 噬菌体对病害控制效果显著，这对完善综合病原体管理（integrated pathogen management, IPM）具有重要意义。
作者为开展研究所用到的主要关键技术方法包括：样本来源于2021年5月至2024年8月加拿大西部不列颠哥伦比亚省、艾伯塔省、萨斯喀彻温省、曼尼托巴省及安大略省的329份表现BSR症状的马铃薯茎与块茎病害样本队列；采用基于结晶紫果胶酸盐（single-layer crystal violet pectate, SL-CVP）培养基的微生物分离与果胶溶解活性测定进行病原初筛；利用种特异性聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增16S rRNA、16S-23S 内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）、tRNA-Glu 及果胶酸裂解酶（pectate lyase, pel）基因（pelE、pelA）进行分子鉴定；通过多位点序列分析（multilocus sequence analysis, MLSA）串联多基因序列构建邻接系统发育树以确定物种分类地位；开展离体块茎接种生物测定（bioassay）评估分离株致病力与损伤直径；从田间病组织悬液中分离裂解性噬菌体并通过双层琼脂法测定噬斑形成单位（plaque-forming units, PFU），结合透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）观察形态及共接种试验评价生物防治效力。
研究结果部分如下：
Results and discussion
在2021年至2024年间，研究人员从艾伯塔省、不列颠哥伦比亚省、曼尼托巴省、萨斯喀彻温省和安大略省的329份症状样本中恢复了281株果胶分解分离株。所有样本均表现出块茎软腐和茎部黑色坏死病灶。经16S rRNA、种特异性PCR及包含16S-23S ITS、tRNA-Glu、pelA 和 pelE 基因的MLSA分子鉴定，所有分离株均为 Pectobacterium 属，未发现 Dickeya 属物种。其中 Pectobacterium carotovorum 为最优势种（n=182），其次为 Pectobacterium polaris（n=62）、Pectobacterium parmentieri（n=28）和 Pectobacterium brasiliense（n=6）。虽然2021至2023年病原谱相对稳定，但2024年伴随传统物种出现了 P. brasiliense，证实了其从卑诗省向其他省份的扩展。整个加拿大西部均未检出 P. atrosepticum，这与过去数十年以 P. atrosepticum 和 P. carotovorum 为主的状况形成显著转变，反映了全球病原种群演化趋势，可能受管理措施、温度耐受性及种薯流动驱动。Dickeya 属的持续缺失表明当前认证体系与区域环境不利于其定殖，为延缓高侵略性病原传入提供了窗口。P. carotovorum 虽仍占主导但呈下降趋势，首次在加拿大报道的 P. polaris 表现出较高侵染力，P. parmentieri 和最具侵染力的 P. brasiliense 检出率上升，所有物种均为种传且无品种抗性差异。预防BSR目前依赖种薯认证、诊断检测及干暖土壤播种等措施，研究人员从田间分离得到属于 Siphoviridae 的裂解性噬菌体 Pebr1，这是首例针对 P. brasiliense 的 Siphoviridae 噬菌体，生物测定显示其共接种使病斑直径减小 >90%，可作为贮前或播前种薯处理剂融入现有喷洒混合液。种植期变暖趋势与传统冷凉土壤利于发病的常识相反，可能与 P. atrosepticum 消失及高温适应性强的 P. brasiliense 等增加有关，北方活力（Northern VigorTM）关联的种子表现提升及敏感田间快速诊断技术发展有助于监测流行病学与致病力，积累数据可辅助人工智能建模解析病害因子。研究显示产业扩张导致种薯跨区流动改变了病害压力与流行病学格局，加拿大西部尚未观测到高侵染力 Dickeya 属，种薯认证与查验延缓了其引入，需结合良好农事与综合病原体管理（IPM）应对气候与产业扩张影响。
讨论部分总结及结论翻译：研究人员讨论指出，过往加拿大西部BSR调查仅记录 P. atrosepticum 和 P. carotovorum，而本研究通过MLSA揭示了物种多样性显著增加，新现 P. polaris、P. parmentieri 及 P. brasiliense 的频繁恢复印证了全球范围内病原组成的演替。尽管低温萌芽通常增加黑胫病发生，但高致病 Pectobacterium 物种甚至在干暖条件下亦能致病，暗示温度变化对病原优势种群更替的影响。田野分离的内生裂解性噬菌体 Siphoviridae Pebr1 对 P. brasiliense 具高度特异性且生物防治效率超90%，拓展了噬菌体库与策略耐久性，混合噬菌体应用可降低溶原化与抗性风险。综合来看，种薯认证结合生物防治构成具成本效益的管理路径，持续监测与IPM策略对于应对病原体多样化、产业扩张及气候挑战至关重要。研究结论为：对2021至2024年加拿大西部马铃薯BSR病原的多位点序列分析与生物测定显示 Pectobacterium 物种多样性增加并确认无 Dickeya 物种；P. brasiliense 等高致病种在暖干条件下亦可致病；分离自田间的 Siphoviridae 噬菌体使 P. brasiliense 病害严重度降低 >90%，为提升产量质量提供环保生物防治；应用综合病原体管理策略将最大限度减少伴随病原多样性增加、产业扩张与气候挑战带来的病害损失。
