《Journal of Biological Chemistry》：Engineering internally His-tagged ESX secretion system fusion antigens for tuberculosis nanoparticle vaccines
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改进的结核病（TB）疫苗是应对该疾病的迫切需求，结核病是全球传染病死亡的主要原因之一。培养滤液结核抗原ESAT6和CFP10形成二聚体复合物，作为结核暴露的免疫标志物及疫苗抗原候选物。研究人员在此报告，与单一抗原相比，使用常规甘氨酸-丝氨酸连接序列表达ESAT
改进的结核病（TB）疫苗是应对该疾病的迫切需求，结核病是全球传染病死亡的主要原因之一。培养滤液结核抗原ESAT6和CFP10形成二聚体复合物，作为结核暴露的免疫标志物及疫苗抗原候选物。研究人员在此报告，与单一抗原相比，使用常规甘氨酸-丝氨酸连接序列表达ESAT6-CFP10融合蛋白显著提高了在大肠杆菌中的表达产量。替换内部的组氨酸标签生成了ESAT(Int7)CFP融合蛋白，其保留了高表达水平，同时可通过固定化金属色谱进行纯化。内部His标签还允许蛋白质与钴卟啉脂质体进行快速偶联。用这些构建体进行免疫可引发抗原特异性抗体和T细胞应答，并在小鼠气溶胶结核攻毒后降低肺部细菌负荷。另一对结核培养滤液抗原EsxH和EsxG作为单独抗原时不产生可溶性蛋白。然而，当用内部His标签连接时，观察到EsxH(Int7)EsxG具有高可溶性表达，并且这种融合抗原在注射CoPoP疫苗后也能在结核攻毒小鼠中赋予保护性免疫。这些发现支持通过工程化融合抗原和纳米颗粒递送平台来设计和制造多价结核病疫苗候选物。
由结核分枝杆菌引起的结核病仍然是全球重大健康威胁。尽管卡介苗被广泛使用，但耐药性结核病的负担不断加重，凸显了开发更有效疫苗的迫切需求。然而过往试验多次遭遇挫折，表明抗原设计与保护效力之间存在持续的差距。此外，单独给予抗原通常不足以引发强烈的适应性免疫应答，因此佐剂和脂质体递送系统显得至关重要。
在此背景下，研究人员着眼于结核分枝杆菌的毒力因子，特别是通过ESX-1分泌系统分泌并形成紧密1:1异二聚体复合物的ESAT6和CFP10，以及通过平行ESX-3系统分泌并参与金属离子获取的EsxG和EsxH。由于这些抗原在单独表达时可溶性表达量极低，限制了其在规模化生产中的应用，研究人员基于已建立的CoPoP脂质体递送平台，开展了针对这些天然二聚体抗原对的工程化融合蛋白疫苗研究。研究人员设计了内部插入七组氨酸标签的融合蛋白，以期提高表达产量、简化纯化步骤，并实现脂质体的快速装载。研究得出结论，内部带有His标签的ESAT(Int7)CFP和EsxH(Int7)EsxG融合蛋白不仅具备高产可溶特性，还能在CoPoP脂质体佐剂CPQ的辅助下引发强烈的体液和细胞免疫应答，并在小鼠气溶胶攻毒模型中显著降低肺部结核分枝杆菌负荷。这项研究为多价结核亚单位疫苗的设计和可制造性提供了创新策略，论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。
为开展此项研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先通过结构引导设计带有内部His标签的重组融合抗原，并在大肠杆菌中进行可溶性表达及通过Ni-NTA进行纯化；利用纳米差示扫描荧光技术进行热稳定性分析；通过Ni-NTA磁珠竞争实验、斑点印迹及荧光猝灭实验评估重组蛋白与CPQ脂质体的结合能力与动力学；在免疫原性研究中，使用来自The Jackson Laboratory的CB6F1/J小鼠（经相关机构IACUC批准）在实验队列中进行肌肉注射免疫，采用ELISA和双色ELISpot检测体液和细胞免疫应答；在 Colorado State University 的BSL-3实验室进行气溶胶结核分枝杆菌攻毒并统计肺部菌落形成单位以评估保护效力。
重组ESAT6、CFP10及C-ESAT-CFP融合蛋白的设计与表达：研究人员基于PDB结构设计了重组抗原，发现使用连接序列融合表达的C-ESAT-CFP蛋白可溶性表达量显著高于单独表达的蛋白，产量提升了3.5倍以上，证明融合策略有效增强了可溶性表达。
使用内部His标签连接体优化融合蛋白表达：研究引入了内部七组氨酸连接体生成ESAT(Int7)CFP，结果显示其保持了极高的表达量。相较之下，带有N端标签的N-ESAT-CFP表达量较低。热稳定性分析表明各构建体具有相似的熔解温度，说明内部标签的引入未显著破坏蛋白质的稳定性。
ESAT-CFP在CPQ脂质体上的结合与结构完整性：通过一系列结合实验证实，带有His标签的融合蛋白能够通过钴-组氨酸相互作用迅速且紧密地结合到CPQ脂质体表面。结合后His标签被完全包埋于脂质双层中，而抗原的ESAT6和CFP10部分结构保持完整并能被特定抗血清识别，脂质体在结合后保持了适中的粒径与低多分散性。
CPQ/ESAT-CFP疫苗引发小鼠体液与细胞免疫：在CB6F1/J小鼠中进行的免疫实验表明，相较于铝佐剂，CPQ/ESAT(Int7)CFP引发了更高滴度的抗原特异性IgG抗体。通过ELISpot检测证实，该制剂显著促进了分泌IFN-γ的脾细胞增殖，证明了CPQ介导的颗粒化抗原展示在增强免疫原性方面的优越性。
CPQ/ESAT-CFP疫苗诱导小鼠抵御结核分枝杆菌攻毒的短期保护：在气溶胶攻毒后三十天，接种基于CPQ的ESAT-CFP疫苗的小鼠肺部细菌负荷显著低于未免疫对照组，起到了明显的保护作用，尽管其保护效力仍不及活疫苗BCG。
EsxH-EsxG融合蛋白的表达：鉴于单一表达的EsxH和EsxG几乎无可溶性产出，研究人员设计连接产生了EsxH(Int7)EsxG与反向构建体。结果证实，内部带有标签的融合蛋白实现了高水平的可溶性表达，再次印证了内部标签策略的可行性。
CPQ/EsxH-EsxG疫苗的免疫原性与保护效力：免疫实验表明EsxH(Int7)EsxG加CPQ引发了强烈的抗体应答及特异性的T细胞应答。在气溶胶攻毒模型中，该疫苗构造显著降低了肺部细菌负荷，且EsxG(Int7)EsxH展现出与BCG较为接近的保护水平。
在讨论部分，研究人员强调了内部多聚组氨酸标签在维持抗原天然二聚体构象及实现高效包载方面的独特机制。与传统的末端标签相比，内部标签在确保高效纯化与脂质体锚定的同时，避免了末端标签可能导致的分子间相互作用阻断或可溶性下降的问题。此外，结合后的标签埋藏于脂质膜内，有效避免了潜在的标签特异性免疫反应。尽管基于亚单位的CPQ疫苗引发的免疫保护效力仍部分弱于具有广谱抗原的BCG活疫苗，且后续仍需优化剂量并评估局部安全性，整体研究仍明确指出；内部带有Int7连接标签的融合抗原由于具备大规模生产的可操作性及成本效益，结合CPQ脂质体展示平台，已成为极具潜力的下一代结核病疫苗候选策略。
