《Advanced Healthcare Materials》：Microfluidic Nano-Assembly of Red-Blood-Cell (RBC) Lipids and Components for Engineering Extracellular Vesicles
编辑推荐：
纳米医学的一个核心挑战是规模化且精确地工程化纳米载体，使其同时具备可调性、免疫相容性以及包载多种生物活性货物（cargo）的能力。包括天然红细胞来源的细胞外囊泡（RBCEVs）在内的细胞外囊质（EVs）具有生物相容性，但受限于其成分异质性、产率低、可扩展性差以
纳米医学的一个核心挑战是规模化且精确地工程化纳米载体，使其同时具备可调性、免疫相容性以及包载多种生物活性货物（cargo）的能力。包括天然红细胞来源的细胞外囊泡（RBCEVs）在内的细胞外囊质（EVs）具有生物相容性，但受限于其成分异质性、产率低、可扩展性差以及对货物装载的控制能力有限。在此，研究人员提出了一种自下而上的策略，通过纯化红细胞（RBC）脂质和成分的微流体扩散混合来开发工程化红细胞细胞外囊质（eRBCEVs）。通过多物理场仿真进行参数优化，实现了对流速、脂质浓度和通道几何形状的预测性控制。eRBCEVs在对不同大小和性质的分子货物的包封效率上表现出可比性，这些货物包括寡核苷酸、金纳米颗粒、血红蛋白、蚯蚓血红蛋白（erythrocruorin，约3.6 MDa）以及完整的腺相关病毒（AAV，约25 nm）颗粒，并通过冷冻电镜（cryo-EM）、化学图谱和高分辨率全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行了验证。研究人员建立了与CD47肽的表面偶联以便与RBCEVs进行比较；与α-PD-L1抗体的生物偶联产生了功能化囊泡，并在PD-L1阳性的人类肿瘤类器官中被摄取。在小鼠体内的生物分布和药代动力学分析表明，其在肝脏、脾脏和肺部有持续循环和组织分布。中性粒细胞激活和巨噬细胞摄取测定证实，与常规颗粒和游离蛋白对照相比，其具有最低的免疫原性。总而言之，该平台能够大规模合成可定制的eRBCEVs，保留了红细胞脂质特征，支持货物灵活性并具有扩大规模的潜力。这项工作将eRBCEVs确立为用于基因治疗、免疫调节和转化纳米医学中可编程、患者特异性递送的下一代治疗平台。
**研究背景与意义**
细胞外囊质（EVs）作为细胞来源的膜结合结构，凭借其内在的生物相容性和穿透生物屏障的能力，在药物递送领域引起了广泛关注。其中，红细胞来源的细胞外囊质（RBCEVs）因其无核的红细胞起源，携带无显著核DNA且天然展示“自我”标记如CD47以逃避吞噬清除，成为一种极具前景的治疗货物递送平台。然而，天然提取的RBCEVs面临异质性成分、低产率、难以规模化以及货物装载控制受限等瓶颈。传统载药方法如电穿孔不仅效率低下，还可能损伤囊泡膜或货物，且难以包裹大分子复合物。此外，非自体来源的生物学囊泡可能携带表面蛋白或生物活性分子，存在引发体内不可预测相互作用的风险。为了克服这些依赖生物发生的合成限制，研究人员开发了一种结合天然与合成纳米载体优势的自下而上平台。该研究将红细胞来源的脂质诱导自组装形成工程化红细胞细胞外囊质（eRBCEVs），不仅克服了传统囊泡提取的局限，还在规模化和可定制性上展现出巨大潜力。由于该平台在基因治疗、免疫调节和转化纳米医学领域的广阔前景，此项成果得以发表在《Advanced Healthcare Materials》期刊上。
**主要关键技术方法**
研究人员为开展此项研究主要采用了以下关键技术方法：首先利用氯仿-甲醇相分离技术提取RBC脂质，并使用质谱分析进行脂质组学表征；其次，基于多物理场计算流体动力学（COMSOL Multiphysics）仿真来模拟和指导微流体装置内流速比（FRR）和通道几何形状的控制；随后，利用压力控制的微流体扩散混合体系自下而上组装合成eRBCEVs；在样本队列来源方面，使用了来自俄亥俄州立大学批准的机构审查委员会方案（IRB #2018H0268）下获取的健康人类供体血液，以及来自杰克逊实验室的BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠的动物模型队列；接着，运用总内反射荧光显微镜（TIRFM）和电子显微镜（EM）进行单颗粒水平的共定位分析和结构化学表征；最后，通过人中性粒细胞和巨噬细胞测定以及小鼠体内生物分布分析评估其免疫学特性与递送效率。
**研究结果**
*RBC脂质提取、成分及eRBCEVs工艺流程*
研究人员通过近保质期RBC提取脂质，并经质谱分析证实其保留了复杂的磷脂成分。通过在微流体控制系统中连续进料，研究人员能够合成成分明确的eRBCEVs，并评估了多种分子货物的包封能力及后续表面修饰，确立了从合成、纯化到体内体外验证的完整工艺流程。
*仿真指导的微流体纳米组装RBC脂质形成eRBCEVs*
通过多物理场仿真，研究人员预测了不同浓度下脂质溶液在微流体通道中的扩散情况，并证实了流速比（FRR）和通道几何结构对多相扩散界面和混合均匀性的关键作用，为实验组装提供了优化的流体动力学参数。
*eRBCEVs的优化与分析表征*
实验通过配置优化的微流体装置，生成了尺寸可调的eRBCEVs。分析表明，与流动聚焦（FF）设计相比，人字形（HB）设计能产生更窄的尺寸分布。研究人员通过多分散性指数（PDI）评估发现，FRR为1:20且脂质浓度为2 mM时能产生均一性最佳的颗粒。此外，-80°C被确认为最佳长期储存条件。
*eRBCEVs结构及纳米货物表征*
通过电子显微镜（EM）和冷冻电镜（Cryo-EM），研究人员证实eRBCEVs具有近圆形和均匀的双层膜“洋葱状”结构。研究表明，eRBCEVs成功包载了不同尺寸的货物，包括金纳米颗粒（AuNPs，包封率47.11%）和人血红蛋白（hHb，包封率77.24%），且保持了血红蛋白与一氧化碳（CO）的结合动力学功能。
*eRBCEVs内货物的高分辨率表征和共定位分析*
通过总内反射荧光显微镜（TIRFM）共定位分析，研究人员验证了多种货物的包封效率，包括FAM标记的寡核苷酸（FAM-O，56.03%）、蚯蚓血红蛋白（LtEc，59.86%）和腺相关病毒（AAV9s，74%）。功能测试表明，eRBCEVs能屏蔽AAV免受中和抗体的作用，维持高效的基因表达递送。
*RBCEVs与eRBCEVs的比较*
对天然RBCEVs和eRBCEVs的对比分析表明，两者在形态学和脂质组分分布上具有很高的相似性。尤其是eRBCEVs不仅重现了RBC膜的囊泡脂质指纹图谱，且未引入合成污染物。在包封效率上，微流体自下而上组装的eRBCEVs显著高于传统的电穿孔（EP）方法。eRBCEVs在表面展示CD47肽的共定位水平显著高于天然RBCEVs。
*探索eRBCEVs引发分离的人中性粒细胞激活*
利用切向流过滤（TFF）优化了eRBCEVs的纯化步骤。通过测定人外周血中性粒细胞的形态变化，研究人员发现，游离血红蛋白和阳离子脂质纳米颗粒（cLNPs）会引发显著的细胞激活，而eRBCEVs及其包载的血红蛋白将激活率从56.19%大幅降至11.6%，证明了该囊泡载体的低免疫原性。
*eRBCEVs表面修饰PD-L1纳米抗体（nPD-L1）偶联及体外研究*
研究人员利用点击化学在eRBCEVs表面成功共价偶联了nPD-L1，并通过TIRFM验证了共定位。在乳腺癌细胞（EMT6）中的实验表明，偶联后的eRBCEVs在37°C下能通过温度依赖的内吞作用有效进入细胞并与溶酶体共定位，展示了良好的靶向递送潜力。
*CD47功能化eRBCEVs的巨噬细胞摄取实验*
为了评估表面CD47肽插入带来的免疫功能，研究人员观察了RAW264.7巨噬细胞对囊泡的摄取。结果显示，功能化eRBCEVs的巨噬细胞摄取率与天然RBCEVs和PBS相近，显著低于bEVs和cLNPs组，证实了CD47功能化能有效降低巨噬细胞的识别与清除。
*eRBCEVs和nPD-L1功能化结合物在老鼠体内的药代动力学、生物分布和安全性分析*
系统性给药后，eRBCEV及其结合物在BALB/c小鼠体内表现出持久的血液循环特性。生物分布分析显示，该囊泡主要在肝脏、脾脏和肺部积聚。值得注意的是，nPD-L1的表面偶联并没有改变eRBCEVs原有的体内行为分布模型。初步毒性评估表明，其未引起明显的系统毒性和脾脏肿大。
*α-PD-L1抗体偶联eRBCEVs在肿瘤类器官中的选择性摄取*
在人乳腺癌类器官的培养模型中，研究人员评估了α-PD-L1抗体修饰的eRBCEVs的靶向特异性。结果显示，该抗体偶联囊泡在PD-L1高表达的MDA-MB-231类器官中表现出高度特异性的摄取和积累，而在低表达的MCF7类器官中则检测不到明显的内化信号，凸显了其作为靶向免疫治疗载体的潜力。
**讨论与结论**
研究人员在最后总结了eRBCEVs平台在临床转化方面的重要考量与优势。研究证明，eRBCEVs作为一种基于红细胞脂质提取物的自下而上合成纳米组装体，能够有效消除传统细胞衍生囊泡成分异质性强和携带潜在致病基因的风险。在规模化潜力上，该微流体平台的产率相较于直接从细胞中提取天然RBCEVs提高了约8 × 10
3倍，单份血液样本能产生超百个临床规格剂量。该合成囊泡通过纯化具有近中性的表面电荷，并能在保留主要红细胞膜脂质特征的同时，通过表面修饰CD47肽进一步提升免疫相容性，降低巨噬细胞的吞噬清除率。通过表面偶联nPD-L1抗体，研究者证明了其在保持囊泡长效血液循环时间的前提下，可实现对PD-L1阳性肿瘤细胞类器官的精准靶向摄取。更为引人注目的是，该囊泡不仅能高效包封脆弱的大分子病毒载体AAV，还能使其免受中和抗体的攻击，恢复了基因在靶向细胞内的长效表达。同时，基于其特殊的膜脂质成分（如含有组成肺表面活性剂的脂质成分），该囊泡表现出在肺部微血管中的良好滞留特性，提示其具有向呼吸道基因治疗递送系统开发的潜力。总而言之，这项研究建立了一种转化为下一代临床应用的细胞仿生纳米载体平台，兼具了生物学囊泡的天然优势与合成载体的可编程精确性，为规模化制备个性化、可定制化的药物递送系统奠定了实质性基础。
