使用人尿路上皮微组织模型模拟导管相关的膀胱黏膜黏附和微创伤

《Advanced NanoBiomed Research》：Modeling Catheter-Associated Bladder Mucosal Adhesion and Microtrauma Using a Human Urothelial Microtissue Model

　　

动物模型已被用于研究泌尿道导管，但小动物不能准确再现人膀胱生理学，也不支持不同类型的导管。三维模型模拟组织微环境的最新进展提高了研究人员对人体组织发育的理解，并使得研究人员能够模拟许多疾病。在此，研究人员的目标是表征与间歇性导尿相关的膀胱尿路上皮黏膜黏附和微创伤。研究人员采用了研究人员的三维尿耐受性人尿路上皮模型（3D-UHU）来研究两种不同类型的间歇性导管：聚维酮（PVP）涂层导管（PVP-CC）和无涂层的集成两亲性表面活性剂（IAS）导管。研究人员证明，将导管按压在模型上2分钟会导致接触区域的3D-UHU模型压缩，通过表面标志物uroplakin III（UPIII）、cytokeratin 20（CK20）和chondroitin sulphate（硫酸软骨素）的免疫荧光染色检测到尿路上皮伞细胞的破坏，同时偶尔出现顶端表面暴露中间层的抹除。与IAS相比，PVP-CC在导管移除后其表面黏附的尿路上皮细胞数量显著更多。此外，PVP-CC的施加和移除导致跨上皮电阻（TEER）降低，表明屏障破坏，而IAS没有引起统计学显著差异。然而，在施加导管碎片后，通过FITC-dextran评估的细胞旁通透性率在模型中没有观察到变化。最后，模型压缩诱导了创伤触发的炎症细胞因子反应。具体来说，研究人员观察到与IAS相比，暴露于PVP-CC后促炎细胞因子IL-1_β以及细胞黏附分子CEACAM1的分泌增加。这些数据表明，3D-UHU模型有望作为动物模型的替代品，用于研究泌尿道导管对尿路上皮的影响。

**论文解读**

**研究背景**
泌尿道导管是临床最常用的医疗设备之一，主要用于帮助排尿功能障碍患者。间歇性导尿（IC）作为金标准，虽优于留置导管，但反复操作可导致尿道创伤和出血，进而增加尿路感染（UTI）风险。现有动物模型（如啮齿类、兔）无法准确模拟人膀胱生理，大型动物（如猪）成本高昂且限制样本量，而人体研究受伦理制约。因此，亟需可重复、接近生理的体外模型来评估导管对尿路上皮的影响。研究人员此前开发了三维尿耐受性人尿路上皮模型（3D-UHU），该模型能分化为7-8层细胞、形成紧密屏障并表达关键生物标志物，且顶端表面耐受100%人尿。本研究利用该模型，比较两种临床常用间歇性导管——聚维酮（PVP）涂层导管（PVP-CC）与无涂层集成两亲性表面活性剂（IAS）导管——引起的膀胱黏膜黏附和微创伤。论文发表在《Advanced NanoBiomed Research》。

**主要技术方法**
研究人员使用HBLAK人膀胱祖细胞（CELLnTEC，瑞士）在Transwell上构建3D-UHU模型，培养18-20天至完全分化。将PVP-CC和IAS导管切割为8-10 mm片段，在移除培养基并半脱水15分钟后，手动按压导管片段于模型表面2分钟（约3 N力），模拟临床导尿停留时间。通过免疫荧光染色（抗UPIII、CK8、CK20、硫酸软骨素抗体）评估细胞损伤；用DRAQ5和WGA标记细胞核与膜；测量跨上皮电阻（TEER）和FITC-葡聚糖（4 kDa）通透性评估屏障功能；采用Luminex多重分析检测12种炎症因子/趋化因子。人尿液（混合性别）购自BioIVT（英国）。

**研究结果**

**3.1 培养基移除对3D-UHU模型的影响**
为模拟体内导尿状态，需移除培养基制造半脱水环境。免疫荧光显示，移除培养基后15分钟，模型出现轻微膜皱褶和DNA碎片，但整体三维结构和细胞层次未受影响，故后续实验采用15分钟脱水条件。

**3.2 导管留置对3D-UHU的影响**
将PVP-CC或IAS导管按压于模型2分钟后，共聚焦显微镜显示接触区域细胞层被压缩、变平，WGA膜染色和phalloidin F-肌动蛋白染色均证实此结构改变，两种导管引起的压缩程度相似。

**3.3 宿主细胞在导管表面的黏附**
导管移除后，对PVP-CC和IAS表面四个区域进行细胞核计数。PVP-CC表面黏附的尿路上皮细胞数量显著高于IAS（p < 0.001），且PVP-CC表面呈鳞片状，而IAS表面更光滑，许多区域无细胞黏附，表明PVP-CC材料更具黏附性。

**3.4 膀胱黏膜微创伤与损伤**
通过免疫荧光分析UPIII、CK8、CK20和硫酸软骨素（GAG层成分）表达。未处理对照组中UPIII、CK20和硫酸软骨素局限于伞细胞层，CK8分布于全层。接触两种导管后，接触区域内UPIII、CK20、硫酸软骨素表达紊乱或消失，CK8在顶层细胞受扰，部分模型出现中间层暴露。非接触区域标志物表达正常，表明损伤为接触依赖性。

**3.5 导管对屏障完整性的影响**
TEER测量显示，PVP-CC处理后屏障电阻显著降低（p < 0.01），而IAS无统计差异，且PVP-CC与IAS间差异显著（p < 0.05）。但FITC-葡聚糖通透性在8和24小时均无显著变化，提示早期紧密连接功能重塑而非大分子泄漏。

**3.6 PVP-CC诱导更高的IL-1_β和CEACAM1分泌**
Luminex检测显示，两种导管均诱导IL-1_α、IL-1_β、IL-18、IL-1Ra、Pentraxin 3、CD44释放增加，但PVP-CC引起的IL-1_β（均值3290.1 vs 2154.89 pg/mL）和CEACAM1（均值23368 vs 20024.4 pg/mL）显著高于IAS（p < 0.05和p < 0.01）。CXCL1、CCL2、IL-8、IL-6、TNF-_α无显著变化。

**讨论与结论**
讨论部分指出，这是首次利用全分层、分化的3D人尿路上皮微组织模型研究导管效应。PVP涂层导管在干燥后黏附性增强，而IAS导管通过两亲性分子减少表面黏性。研究证实导管接触导致伞细胞标志物（UPIII、CK20、硫酸软骨素）丢失和细胞脱落，PVP-CC引起更显著的细胞黏附、屏障破坏（TEER下降）及促炎反应（IL-1_β、CEACAM1升高）。尽管FITC-葡聚糖通透性未变，但TEER下降提示早期紧密连接功能受损。结论部分翻译如下：

**结论**
本研究首次使用3D人膀胱微组织模型研究导管对尿路上皮的影响。通过将两种不同IC导管应用于3D-UHU模型，研究人员开发了一种新型体外平台用于研究导管诱导的创伤。这些发现共同支持一个导管诱导尿路上皮微创伤模型：导管接触对浅表尿路上皮施加压缩和剪切力，导致伞细胞破坏和部分脱落，以及关键顶端分化标志物（包括UPIII、CK20和硫酸软骨素）的丢失。尿路上皮细胞在导管表面黏附增加进一步提示导管移除导致机械性剥脱或浅层细胞损伤，与观察到的伞细胞相关标志物紊乱一致。这种结构性损伤伴随TEER降低，表明早期紧密连接功能障碍和离子屏障完整性受损，尽管缺乏明显的FITC-葡聚糖通量，提示存在细微但功能显著的屏障缺陷而非显著上皮破裂。同时，IL-1_β和CEACAM1分泌增加支持导管诱导损伤后继发的先天性炎症和上皮应激反应激活，且炎症反应强度与细胞黏附和屏障破坏程度相关。该系统为未来开发可处理的早期导管测试平台奠定了基础，可作为动物模型和临床研究的比较系统。