统一的高效液相色谱-电喷雾电离-高分辨质谱方法用于复杂核废液中四种氨基多羧酸和葡萄糖酸的定量分析。A部分：方法开发与验证

《Journal of Chromatography A》：A unified HPLC-ESI-HRMS approach for the quantitative analysis of four aminopolycarboxylic acids and gluconic acid in complex nuclear effluents. Part A: Method development and validation

　　

在复杂放射性废液中分析螯合剂极具挑战性。研究人员通过高效液相色谱-电喷雾电离-高分辨质谱（HPLC-ESI-HRMS）建立了四种氨基多羧酸和葡萄糖酸（gluconic acid）的统一方案。在整个样品制备过程中进行了深入的模拟形态研究。新方案通过准确度曲线和ISO/TS 22176标准进行了验证。

核废液中存在多种螯合剂，如乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）等，它们因与稀土、锕系和过渡金属形成强络合物而被用于核工业去污过程。然而，这些螯合剂可能促进放射性核素和重金属在水中的迁移，因此在废物处置前需定量评估其含量。法国国家放射性废物管理机构（ANDRA）要求定量五种优先有机配体：四种氨基多羧酸（aminopolycarboxylic acids, APCAs），即次氮基三乙酸（nitrilotriacetic acid, NTA）、EDTA、二乙烯三胺五乙酸（diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA）、三乙烯四胺六乙酸（triethylenetetraminehexaacetic acid, TTHA），以及葡萄糖酸（gluconic acid）。实际核废液样品为高盐（2 mol/L NaNO₃）、高重金属（每种高达10 mmol/L）、高悬浮固体（~160 g/L）、强酸性（pH 2-3）且高放射性（约5 GBq/m³ β/γ发射体）的污泥，直接分析面临巨大挑战。此前针对EDTA和葡萄糖酸分别开发了基于高效液相色谱-低分辨质谱（HPLC-LRMS）的方法，但存在稀释倍数大、干扰物无法区分、定量限不理想以及样品制备耗时等问题。为解决这些挑战，并统一两种历史方法，研究人员开展了此项研究，旨在开发一种能够同时分析五种螯合剂的统一高效液相色谱-电喷雾电离-高分辨质谱（HPLC-ESI-HRMS）方法，并优化其性能。

研究人员首先在模拟污泥（非放射性合成溶液，其成分与真实放射性污泥高度相似，作为最坏情况模型）上开展工作。关键方法包括：样品制备步骤基于EDTA旧方案，通过添加内标（¹³C或氘代标记物）、过滤、碱化（NH₄OH）沉淀金属、离心取上清液、加入过量Ni²⁺离子（~1 mmol/L）并加热（50℃ 2 h）形成Ni-螯合剂络合物，最后稀释25倍以降低基质效应。分析采用高效液相色谱（HPLC）系统，配备C18苯基-己基色谱柱，以三丁基胺（tributylamine, TBA）为离子对试剂进行梯度洗脱，质谱采用高分辨Orbitrap（Q Exactive Focus）分析器，负离子模式单离子监测（SIM）检测。通过设计实验（DoE）优化加热电喷雾电离（ESI）源参数（包括鞘气、辅助气、吹扫气流量、喷雾电压、毛细管温度、S-lens RF水平和辅助气温度）。方法验证遵循ISO/TS 22176标准，使用准确度曲线（accuracy profiles）评估七个系列、多个浓度水平（0.01-2 mg/L）的校准和验证样本。

研究结果按小标题总结如下：
**3.1 光谱干扰解析（Spectral interferences resolution by LC-HRMS）**：通过高分辨质谱，研究人员在标准溶液中鉴定出与NTA（m/z 245.9554）等压的干扰物⁶⁰Ni(NO₃)₃^-（m/z 245.8948），两者质量差为0.0606 m/z，在低分辨质谱下无法区分。HRMS的应用有效消除了此类等压干扰，避免了误定量风险。
**3.2 螯合剂化学形态的确定（Determination of chemical species for the chelating agents with speciation simulation）**：利用JChess软件进行形态模拟，结合更新的数据库（包含更多络合物与沉淀物）。模拟显示，在样品制备后（去除Fe³⁺、Cr³⁺等易沉淀金属，保留Ni²⁺），NTA、EDTA、DTPA和TTHA均形成以Ni-螯合剂阴离子络合物为主的形态（如Ni-EDTA^2-、Ni-NTA^-等），且pH 4-7范围内稳定。对于葡萄糖酸，尽管添加过量Ni²⁺，由于NiGlu⁺络合物仅占次要地位，主要形态仍为游离葡萄糖酸根阴离子（Glu^-）。因此，基于离子对机制的统一色谱方法适用于所有五种螯合剂。
**3.3 ESI源参数优化（Optimisation of the ESI source parameters）**：采用2^7-3部分因子设计实验，评估七个ESI参数对五种螯合剂信号强度的影响。结果表明，扫气流量（负效应）、喷雾电压（正效应）和辅助气温度（正效应）影响显著，而毛细管温度和S-lens RF水平影响有限，鞘气和辅助气流量无显著影响。制造商推荐的参数组合（如喷雾电压-2.5 kV）即为最优，保证了方法稳健性；提高喷雾电压至-4 kV虽可倍增信号，但会导致电火花，不利于针尖。
**3.4 模型污泥中的方法验证（Method validation in a model sludge）**：采用完整8点线性、截断5点线性（仅低浓度点）和8点二次三种校准曲线进行验证。准确度曲线显示，对于DTPA，完整线性曲线在最低验证水平（DTPA/DTPA*=0.04）未通过，截断曲线则通过并降低低浓度偏差；NTA的完整线性曲线无法验证最低两个水平，截断曲线成功验证；EDTA、TTHA和葡萄糖酸的定量限（LOQ）位于前两个验证水平之间。综合来看，截断或二次模型提供了更低的总体偏差。最终在污泥中的LOQ为2.5-6.25 mg/L，回收率估计为60%（EDTA）至95%（DTPA），证实了Ni-络合物的主导地位。

讨论部分指出，方法验证中不同校准曲线模型的选择取决于螯合剂浓度，NTA需采用高低浓度不同校准曲线。当前LOQ的主要限制来自样品制备中250倍的稀释倍数（为降低基质效应），未来可针对特定废液调整稀释因子。此外，观察到DTPA在预设条件下本应形成双镍络合物，但实际仅检测到单镍络合物，表明存在形态变化偏差。这些发现将引入后续文章（Part B）深入探讨色谱柱和ESI源中的形态变化及基质效应起源。

研究结论部分翻译如下：研究人员开发了一种用于放射性污泥中五种螯合剂同时分析的方法。样品制备通过去除初始存在的多数金属并添加过量镍离子，获得了每种螯合剂的主导形态。形态模拟预测，NTA、EDTA、DTPA和TTHA与Ni²⁺形成的阴离子络合物在样品制备后占主导地位；在相同条件下，葡萄糖酸根阴离子亦为优势形态。研究人员不仅将EDTA的HPLC-LRMS方案转移至新一代高分辨质谱（Orbitrap）和超高效液相色谱系统，还将其扩展至包括葡萄糖酸及其他三种EDTA家族分子。高分辨质谱的应用从此杜绝了在低分辨质谱中非常棘手的未知等压干扰物检测。增强的形态模拟纳入了更多物种，因此更加稳健。类似样品制备方法可适用于其他复杂水溶液中的分子。统一方案基于ISO/TS 22176标准，通过准确度曲线在污泥中验证了所有五种螯合剂的定量限，范围为2.5-6.25 mg/L。根据螯合剂浓度，可采用不同校准曲线模型以实现更高准确度。特别是NTA需要高浓度和低浓度样品分别采用线性以及仅使用五个最低校准水平的线性校准曲线。本工作描述的统一HPLC-HRMS方法能够在极短分析时间内实现对污泥中五种络合剂的准确灵敏定量，同时消除干扰物。本研究提供了可直接用于放射性污泥分析的即用方案。目前LOQ的主要限制是样品制备过程中必须稀释污泥250倍以限制基质效应。这些基质效应和稀释与目标样品紧密相关，并可能需针对其他放射性废液进行调整。然而，对这一问题的研究引出了一个关键问题，即每种螯合剂预期形态与检测形态之间存在差异。例如，DTPA被认为应与两个镍离子形成络合物，但在当前条件下仅检测到单镍络合物。因此，后续文章将展开补充讨论，以揭示整个分析过程中（包括HPLC色谱柱和ESI源内）发生的形态变化以及基质效应的起源。了解每一步中每种螯合剂的形态将为分离机制和基质效应提供新见解，并对进一步方法开发至关重要。