液相色谱-离子迁移-质谱法筛查血浆中D-氨基酸变化的方法开发

《Journal of Chromatography A》：Development of a liquid chromatography - ion mobility - mass spectrometry method for the screening of D-amino acid alterations in plasma

　　

手性是生物系统的一个基本特性，也是许多必需生物分子（包括蛋白质、糖类和氨基酸）的自然属性。除甘氨酸外，所有蛋白质氨基酸均具有一个手性中心，产生两种对映体，它们在空间排列和构象结构上有所不同。虽然L-氨基酸因其基本生物学作用而被广泛认可，但D-氨基酸历史上被视为人体的非天然组分。研究人员通过Dunlop等人发现哺乳动物体内存在游离D-天冬氨酸，以及随后D-丝氨酸作为一种内源性代谢物的鉴定，证明D-氨基酸是哺乳动物系统中天然存在的化合物。此后，大量研究探讨了它们的生物学作用和代谢意义，并发现其与阿尔茨海默病、精神分裂症、抑郁症、肌萎缩侧索硬化症、癌症或慢性肾病（CKD）等病理相关。在这些疾病中，CKD对全球健康影响显著，年支出超过任何其他疾病类别，是全球第三大增长最快的死因，全球患病率约为14%。尽管D-氨基酸具有重要的生物学和临床意义，但由于其在生物基质中通常以痕量水平存在，其准确测定在分析上仍具有挑战性。此外，由于结构异质性，在单一分析平台中同时检测所有19种D-和L-氨基酸很少实现。尽管已开发出直接和间接方法用于其分析，但直接方法通常局限于相对较小的分析物组。对于多种D-氨基酸的分析，基于手性衍生化试剂（CDA）进行柱前衍生化的间接方法更为流行。手性衍生化可提高选择性和灵敏度，形成的非对映体可在非手性环境下分离。然而，CDA的手性纯度仍然是重要的误差来源，尤其对于痕量D-氨基酸的分析。最近的综述强调了敏感分析平台的发展推动手性氨基酸分析取得了显著进展。在可用的分析技术中，液相色谱-质谱联用（LC-MS）仍然是生物样品中氨基酸手性分析的主要分析平台。更具体地说，多维高效液相色谱系统，如二维（2D-LC）和三维（3D-LC）平台，已被开发用于复杂生物基质中蛋白质氨基酸的手性分析，因为它们可以结合不同固定相化学性质以增强选择性和分辨率。然而，尽管具有高分离能力，许多此类多维色谱方法在分析上仍然复杂且技术要求高，这可能限制其在大规模生物学或临床研究中的更广泛应用。尽管离子迁移质谱（IMS）不能提供直接的对映体分离，但IMS已作为非对映体分析的互补分析平台出现。在用CDA衍生化D-和L-氨基酸后，产生的非对映体表现出不同的物理化学性质——最显著的是碰撞截面（CCS）差异——使其可通过IMS区分，从而提供额外的分离维度并提高识别置信度。这种方法先前在少数不同研究中被探索，侧重于评估和优化用不同衍生化试剂（如（+)-1-(9-芴基)乙基氯甲酸酯（(+)-FLEC）、(S)-萘普生酰氯或(S)-NIFE）衍生化后氨基酸的手性分析，但其在复杂基质中的适用性仍然有限。基于先前研究的观察，本研究旨在开发一种基于间接对映体分离策略的高选择性LC-MS方法，用于血浆中手性氨基酸的分析。该方法设计依赖于商业可得的CDA、常规色谱柱和简单的衍生化方案，确保易于实施。重点是在单个分析运行中达到所需的手性选择性，以确保在不同临床研究场景中的适用性。本研究的一个显著分析进步是将IMS整合到工作流程中，与常规方法相比，这提供了额外的分离维度，可提高分析选择性并增强化合物区分和注释的置信度。

**研究背景、问题及研究意义**
手性是生物系统的核心特征，蛋白质氨基酸（除甘氨酸外）均具有手性中心，存在L-和D-两种对映体。历史上D-氨基酸被视为非天然成分，但后续研究发现其在哺乳动物中天然存在，并与多种疾病（如阿尔茨海默病、精神分裂症、抑郁症、肌萎缩侧索硬化症、癌症及慢性肾病（CKD））相关。CKD是全球第三大增长最快的死因，患病率约14%，且D-氨基酸在血浆中的水平改变与肾功能下降密切相关。然而，D-氨基酸的准确测定面临两大挑战：其在生物基质中通常为痕量水平，且同时检测所有19种蛋白质氨基酸的对映体在单一分析平台中难以实现。现有方法（如多维液相色谱）虽能提供高分辨率，但分析复杂、技术要求高，限制了大规模应用。离子迁移质谱（IMS）作为正交分离维度，虽不能直接分离对映体，但可通过碰撞截面（CCS）差异辅助区分非对映体，提高识别置信度，然而其在复杂基质中的应用仍有限。为此，研究人员开发了一种基于商业手性衍生化试剂（CDA）的液相色谱-离子迁移-质谱（LC-IM-MS）方法，旨在实现血浆中所有蛋白质氨基酸对映体的快速手性分析，并以CKD患者血浆为模型验证其临床适用性。该论文发表在《Journal of Chromatography A》。

**关键技术方法**
研究人员采用间接手性分离策略，以(S)-N-(4-硝基苯氧羰基)苯丙氨酸甲氧基乙酯（(S)-NIFE）为CDA进行柱前衍生化，形成非对映体后在常规Phenyl-Hexyl色谱柱（100×2.1 mm，1.7 μm）上实现基线分离。流动相为50 mM乙酸铵（pH 5.6）和甲醇，梯度洗脱20分钟。通过设计实验（DoE）优化pH、初始有机相比例和温度。检测采用超高效液相色谱（UPLC）结合行波离子迁移质谱（TWIMS），在正离子电喷雾电离（ESI）模式下以数据非依赖采集（HDMSE）模式运行，获取CCS值作为正交鉴定参数。血浆样本来自30例CKD晚期（4-5期）患者和30例健康对照，经蛋白沉淀和磷脂去除后衍生化分析。定量分析选取D-天冬酰胺、D-丝氨酸、D-谷氨酰胺和D-丙氨酸四种D-氨基酸，采用背景扣除法构建标准曲线，利用受试者工作特征（ROC）曲线和肯德尔秩相关分析评估诊断性能。

**研究结果**
- **Development of the chromatographic method（色谱方法开发）**
研究人员比较了两种CDA（(+)-FLEC和(S)-NIFE）在五种固定相上的分离效果，发现(S)-NIFE衍生物在Phenyl-Hexyl柱上提供最佳选择性，且以甲醇为有机改性剂时pH影响较小。通过DoE优化，在pH 5.6、初始甲醇10%、温度40°C条件下，所有19种手性氨基酸的非对映体在20分钟内实现基线分离（分辨率>1.8），检测限约12 nM（除His 25 nM，Asp/Glu 50 nM，Cys 100 nM）。

- **Ion mobility mass spectrometry of (S)-NIFE derivatized amino acids（离子迁移质谱分析(S)-NIFE衍生化氨基酸）**
行波离子迁移质谱分析显示，D-和L-衍生物之间的CCS值存在微小但一致的差异，双衍生化氨基酸及Na⁺、K⁺加合物的差异更大。尽管IMS单独无法分离非对映体，但CCS值作为正交鉴定参数，与保留时间、质荷比、同位素分布和碎片化评分结合，提高了识别特异性。

- **Sample preparation for chiral analysis of AAs in plasma（血浆中氨基酸手性分析的样品前处理）**
采用Phree^?磷脂去除管同时进行蛋白沉淀和磷脂去除，优化后以乙腈为沉淀剂。手性纯度验证显示(S)-NIFE的对映体纯度>99.9%。衍生化重复性良好，低浓度（0.2 μM）相对标准偏差（RSD）<5%（除D-Ile和D-Tyr），高浓度（10 μM）RSD<2%。自动进样器稳定性（24 h，10°C）显示除D-His外，其余分析物峰面积偏差均在±15%以内。基质效应评估表明，未衍生化基质对电离影响小（回收率94.4-110.7%），但衍生化基质对D-Ser、D-Ala和D-Val的回收率影响较大（分别由共洗脱的L-瓜氨酸、L-异亮氨酸和γ-氨基丁酸衍生物导致），但变异较小（SD<10%）。

- **Application to CKD plasma samples（在CKD血浆样本中的应用）**
在30例CKD患者和30例健康对照血浆中检测到14种D-氨基酸。主成分分析（PCA）和无监督层次聚类显示两组间明显分离，多数D-氨基酸在CKD组中升高（倍数变化2.24-4.91），仅D-Phe降低（FC=0.70）。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型稳健（Q2≈0.91，p<5×10??），变量重要性投影（VIP）分析显示D-Lys、D-Ala、D-Met、D-Asn、D-Thr和D-Ser是区分两组的关键代谢物。定量分析后，D-Ser和D-Asn的ROC曲线下面积（AUC）分别为0.997和0.954，表现出优异的判别能力；D-Ala AUC为0.902；D-Gln AUC为0.609。肯德尔相关分析显示D-Asn和D-Ser与血清肌酐呈正相关（τ=0.580和0.465，p<0.001），与估算肾小球滤过率（eGFR）呈负相关（τ=?0.393和?0.352，p=0.002和0.006），而D-Ala和D-Gln与肾功能指标无显著相关，提示其水平变化可能受其他因素影响。

**结论翻译**
开发了一种高选择性的超高效液相色谱-离子迁移-质谱（UPLC-IM-MS）方法，采用(S)-NIFE间接衍生化，用于蛋白质氨基酸的手性分析。该方法可在20分钟内对全部19种手性氨基酸实现基线分离，相比现有方法（通常仅提供部分对映体分离或分析时间较长）有显著进步。此外，对五种固定相在非对映体分离中的能力进行了广泛评估，为非对映体分析中色谱柱的理性选择提供了见解。离子迁移质谱揭示了D-和L-衍生物之间CCS值的微小但一致的差异，这些差异随后被用作正交注释参数。因此，IMS通过其额外的分离维度增强了识别置信度，代表了本工作流程的重要分析进步。然而，重要的是，IMS并非实施该方法的先决条件，因为色谱分离可轻松在任何常规LC-MS平台上实现，使其成为手性氨基酸分析的多功能且易获取的工具。作为概念验证应用，新开发的方法被用于研究4期和5期CKD患者血浆中D-氨基酸的变化，发现大多数D-氨基酸水平相比健康对照升高。此外，对四种D-氨基酸（D-Asn、D-Ser、D-Gln和D-Ala）进行了定量，ROC分析显示D-Ser具有最强的判别能力（AUC=0.997）。