基于双值法的用于质量评价和Q标记物筛选的集成色谱指纹图谱策略：以血止康胶囊为案例研究

《Journal of Chromatography B》：An integrated chromatographic fingerprinting strategy for quality evaluation and Q marker screening based on the bi value method: A case study of Xuezhikang capsules

　　•Bi值法能够实现雪芝康胶囊的高分辨率鉴定与质量分级。•一种新的PRI指标可量化色谱分离能和系统完整性。•HPLC与电化学指纹图谱能揭示互补的质量差异。•将Pm与活性相结合，可识别功能性Q标记物，为基于功能的质量控制提供支持。

引言
中药制剂通过多成分、多靶点的整体调节，在疾病预防与健康维护方面发挥着独特作用[1]。然而，由于原材料的批次差异、生产过程的波动以及稳定性问题，确保质量一致性仍面临挑战[2]、[3]。现代质量控制策略已超越了传统药典标准，后者依赖于有限数量的标志化合物[2]。通过整合现代分析技术，如色谱指纹图谱、多成分定量分析及生物功效测定，得以建立中药制剂的品质分级体系，极大提升了质量控制的系统性与科学性[4]。同时，化学特性分析与生物活性评估的结合范围也在不断扩大，从复杂的草药基质到精准设计的纳米药物，进一步增强了质量控制的科学性[5]、[6]。

质量标记物（Q-Marker）的概念通过识别与治疗功效相关的化学成分，提高了识别的特异性[7]、[8]。然而，早期的Q标记物筛选方法较为零散，需要跨学科整合，这一过程既复杂又耗费资源[9]、[10]、[11]。因此，迫切需要开发一种新颖且简便的标准，能够直接将化学信息与药理特性关联起来，从而实现高效准确的Q标记物识别。本研究以雪芝康胶囊为案例，探讨了中药制剂的品质评价体系与Q标记物筛选策略的构建方法。

雪芝康胶囊是由红曲发酵制成的，其主要活性成分为洛伐他汀，同时还含有不饱和脂肪酸、黄酮类化合物及其他代谢物等协同作用的生物活性物质[12]、[13]。临床研究表明，雪芝康胶囊能够显著降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇，同时提高高密度脂蛋白胆固醇水平[14]、[15]。其在治疗高血脂症和心血管疾病方面的疗效与传统他汀类药物相当甚至更优，具有更强的生物活性、更好的效果以及更高的安全性，优于合成洛伐他汀[16]、[17]。

高效液相色谱法已成为中药制剂质量控制的核心技术，它能够准确分离、鉴定并量化复杂的化学成分，从而确保产品的真实性、一致性和有效性[18]。不过，传统HPLC方法依赖于有限的标志化合物，可能会忽略整体草药成分中细微但重要的差异，也无法充分反映生物活性，从而导致质量评估不够全面[19]、[20]。在像雪芝康胶囊这样的发酵产品中，这些局限性更为突出：复杂的成分构成和较大的极性范围使得活性成分在样品制备和色谱分离过程中容易丢失或降解，进而削弱了化学指纹图谱与生物活性之间的关联。更关键的是，HPLC仅能提供静态的成分信息，无法体现多成分的协同作用、基质效应或整体的药理作用，因此其在预测治疗效果和质量方面存在局限。为克服这些缺陷，基于HPLC的色谱指纹图谱技术取得了新进展，提供了一种综合性的分析策略，能够呈现整体的化学特征而非孤立的峰谱[21]。化学计量学的进步也使得相似性评估更加精确。在本研究中，我们提出了一种先进的指纹图谱评估方法——Bi值法。该方法利用宏观定性相似度（Sm）和宏观定量相似度（Pm）两个参数来进行物种鉴定和质量评估。此外，通过将Pm与药理功效相关联，还建立了一种新的Q标记物选择模型。该方法通过提升模式识别能力和药效相关性，弥补了传统HPLC的不足，为中药制剂提供了更为稳健和全面的质控框架。

复杂的基质会因峰重叠、对pH值/温度的敏感性以及污染等问题而增加HPLC分析的难度[22]。要进行准确评估，就需要考量色谱分离效率与信息含量，仅依靠柱数或分辨率等单一参数是不够的。为解决这一问题，人们提出了峰分离信息能量指数（PRI）这一综合参数，它能同时监测分离效率、信息熵和分子能量。这一统一的定量指标有助于全面评估和监控复杂的指纹图谱系统，类似的方法也可应用于其他复杂系统，其中复合数字特征能够有效支持基于机器学习的建模，实现自动、客观的系统评估[23]。它为制药、食品和环境领域的质量标准化及过程分析技术提供了新颖而强大的理论工具。

抗氧化能力是天然产物和中药的重要功能指标[24]。雪芝康胶囊富含单甲醇酮、黄酮类化合物及酚类物质，具有很强的抗氧化作用。其抗氧化机制包括两种协同途径：通过氢原子转移或单电子转移直接清除自由基，以及抑制NADPH氧化酶的活性，从而减少活性氧的生成[12]、[25]。为了全面评估其直接清除自由基的能力以及对氧化还原反应的动态调控能力，本研究采用了两种互补的方法。基于氢原子转移/单电子转移机制的经典DPPH试验，能够有效检测雪芝康胶囊的“静态”自由基清除能力[26]、[27]，但它无法检测那些与DPPH反应不佳的具有生物学意义的还原性成分[28]、[29]。相比之下，贝卢索夫-扎博廷斯基振荡反应是一种非线性氧化还原系统，对雪芝康胶囊中的各种成分非常敏感[30]、[31]。这些成分会与B-Z反应中的关键中间体（如HBrO2、Br?、Ce4+）发生相互作用[32]、[33]，进而改变振荡周期等参数，从而动态反映复杂多变环境下的整体抗氧化能力。此外，通过记录加入中药成分后的电极电位-时间曲线，还可以构建“电化学指纹图谱”，以反映整体的电化学活性[34]、[35]、[36]。越来越多的先进数学框架被用于分析多维化学数据集，从而提取具有生物学意义的见解[37]。然而，传统的偏最小二乘法通常基于单一的HPLC指纹图谱数据，往往无法捕捉复杂中药中各活性成分的整体作用，可能导致所筛选出的Q标记物虽在统计上存在相关性，但却与临床疗效和安全性缺乏明确的函数关联[38]。在本研究中，通过结合使用DPPH自由基清除试验、B-Z振荡阻抗分析以及PLS耦合的指纹图谱-活性建模，不仅提高了抗氧化能力评估的可靠性，还有效解决了传统基于PLS的中药质量评估方法存在的局限性。这种综合方法有助于筛选出既具有较强抗氧化能力又具有独特色谱特征的潜在Q标记物，从而建立起化学特性与药理潜力之间更为精确的关联。

本研究的核心目标是构建一个系统的中药制剂质量评价与Q标记物筛选框架。为此，本研究基于HPLC和电化学指纹图谱技术，建立了所谓的Bi值法这一双重相似度评估体系，并引入PRI参数来监测指纹图谱系统的整体状态。此外，还通过DPPH自由基清除试验和B-Z振荡阻抗测试对样本的抗氧化能力进行了全面验证。最后，通过研究定量指纹图谱相似度与药理功效之间的内在关联，为本研究提供了新的理论基础和实践方法，有助于高效准确地识别Q标记物，并实现对中药制剂的质量分级。

部分内容摘录
试剂与化学品
本研究共获得了30批雪芝康胶囊样本，编号为S1–S30，这些样本来自北京北京大学威博莱生物科技有限公司（见表S1）。甲醇（色谱级）和乙腈（色谱级）购自中国山东的禹王化学试剂有限公司；磷酸（色谱级）则购自中国天津的天津凯米奥化学试剂有限公司。浓硫酸（分析纯度）则购自连云港龙博华 Pharmaceutical Chemistry公司。

方法学验证
由于256纳米波长处该样品具有良好的色谱分离效果、较强的紫外吸收强度，且在该波长下可见大量且强度较高的指纹峰，因此选择256纳米作为最佳检测波长（见图S1）。在此条件下，共识别出19个常见峰，其中第8个峰的峰形和分辨率最佳，被选为参考峰。随后计算了这些常见峰的相对峰面积和相对保留时间。

结论
本研究通过整合HPLC指纹图谱分析、电化学指纹图谱分析、化学计量学建模以及抗氧化能力测定，为雪芝康胶囊建立了一个系统化的、以功能为导向的质量评价体系。同时，还将Bi值法和PRI应用于30批样本的质量评估。HPLC指纹图谱分析表明，Bi值法能够实现定性和定量评估，可将样本分为三个质量等级，总体质量较高。

CRediT作者贡献说明
王佳敏：撰写原始稿件、验证、方法学设计、实验研究、正式分析、数据整理。王倩：实验研究、正式分析。丁文静：验证、正式分析。薛兰：监督、资源协调。刘希：监督、资源协调。裴欢：监督、资源协调。闫辉：监督、资源协调、资金筹集。兰莉莉：监督、资源协调、资金筹集。孙万阳：资源协调、资金筹集。孙国祥：监督、软件应用、项目管理。

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：81573586、82404858、81703696）、辽宁省教育厅（项目编号：LJ212410163028）以及中国博士后科学基金会博士后 Fellowship Program（项目编号：GZB20250903）的支持。

王佳敏|王倩|丁文静|薛兰|刘希|裴欢|闫辉|兰莉莉|孙万阳|孙国祥