《Journal of Ethnopharmacology》：Guizhi Wuling Decoction alleviates myocardial fibrosis by restoring mitochondrial homeostasis: Evidence from network pharmacology, molecular docking, and multi-omics integration
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民族药理学相关性：桂枝苓武汤（Guizhi Wuling Decoction，GWD）是由经典方剂五苓散与桂枝茯苓丸未经加减组合而成的复方，已在心血管疾病中临床应用。既往研究报道了其心脏保护和抗纤维化效应，然而潜在分子机制仍不完全明确。研究目的：探讨恢复线粒体
民族药理学相关性：桂枝苓武汤（Guizhi Wuling Decoction，GWD）是由经典方剂五苓散与桂枝茯苓丸未经加减组合而成的复方，已在心血管疾病中临床应用。既往研究报道了其心脏保护和抗纤维化效应，然而潜在分子机制仍不完全明确。研究目的：探讨恢复线粒体稳态是否参与GWD的抗纤维化效应，并探索AMPK（AMP-activated protein kinase）/PGC-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α）信号的参与情况。材料与方法：通过异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）给药在C57BL/6 J小鼠中诱导心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）。评估心功能、心肌纤维化、线粒体超微结构、线粒体膜电位、ATP生成和NAD+/NADH比值。采用UHPLC-MS/MS表征GWD含药血清中的吸收成分。整合转录组-蛋白质组分析凸显AMPK信号作为与GWD治疗相关的重要通路之一。进行分子对接和分子动力学模拟以评估代表性吸收化合物与候选靶点之间的相互作用。通过使用Compound C的药理学抑制进一步验证AMPK信号的参与。结果：GWD显著改善心功能，减轻心肌纤维化并恢复线粒体稳态，表现为线粒体超微结构改善、线粒体膜电位升高、ATP生成和NAD+/NADH比值增加。整合转录组和蛋白质组分析确定AMPK信号是GWD保护效应相关的重要通路。机制上，GWD激活AMPK/PGC-1α信号通路并上调线粒体生物发生和质量控制相关蛋白，包括NRF1、TFAM和MFN2（mitofusin-2）。Compound C对AMPK的药理学抑制显著减弱GWD相关的线粒体稳态改善和抗纤维化效应。结论：GWD至少部分通过恢复线粒体稳态减轻ISO诱导的MF。整合多组学分析和药理学验证提示AMPK/PGC-1α信号可能参与GWD的抗纤维化效应。这些发现提供了提示线粒体稳态参与MF的实验证据，并为GWD的抗纤维化效应提供了新见解。
该研究围绕心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）这一多种心血管疾病的共同病理终点展开。目前指南推荐疗法如血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂等虽能改善心血管结局，但对已形成的纤维化重塑逆转能力有限。累积证据表明线粒体稳态破坏是MF的核心致病事件，AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α，PGC-1α）信号在维持线粒体生物发生与动态平衡中起关键作用。桂枝苓武汤（Guizhi Wuling Decoction，GWD）由五苓散与桂枝茯苓丸合方而成，临床用于血瘀水停型心力衰竭且显示心脏保护与抗纤维化潜力，但其如何通过多组分协同调控线粒体稳态尚不清楚。研究人员通过整合网络药理学、转录组学、蛋白质组学、分子对接及体内实验，探究GWD抗MF是否依赖恢复线粒体稳态及AMPK/PGC-1α通路参与，论文发表于《Journal of Ethnopharmacology》。
研究人员主要采用以下关键技术方法：使用C57BL/6 J雄性小鼠通过皮下注射异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）建立MF模型，设假手术组、模型组、GWD低中高剂量组、卡托普利对照组及AMPK抑制剂Compound C干预组；通过超声心动图评估心功能，组织学染色评估纤维化，透射电镜观察线粒体超微结构，检测ATP、NAD+/NADH及线粒体膜电位（ΔΨm）；采用UHPLC-MS/MS鉴定GWD含药血清吸收成分；开展网络药理学预测化合物-靶点并富集分析；进行心肌组织转录组与蛋白质组测序及整合分析；实施分子对接与100 ns分子动力学模拟评估化合物与AMPK相互作用；通过Western blot、免疫组化、qPCR验证AMPK/PGC-1α通路及线粒体生物发生与动力学相关蛋白和mRNA表达，并以Compound C药理学抑制验证通路必要性。
研究结果如下：
3.1. GWD attenuated myocardial injury and fibrosis in MF mice
研究人员通过超声心动图、血清CK-MB与NT-proBNP检测、H&E与Masson染色及α-SMA免疫组化分析，发现GWD显著提高射血分数（ejection fraction，EF）与短轴缩短率（fractional shortening，FS），降低损伤标志物，减轻心肌结构紊乱与胶原沉积，减少α-SMA阳性面积，表明GWD减轻MF小鼠心肌损伤与纤维化重塑。
3.2. GWD ameliorated inflammation and oxidative stress in MF mice
通过ELISA、DHE荧光染色与生化检测，研究人员发现GWD降低血清促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α，升高抗炎因子IL-10，减少心肌ROS积累，降低MDA并升高SOD与GSH，表明GWD减轻MF小鼠炎症与氧化应激。
3.3. GWD improved mitochondrial structure and bioenergetic function in MF mice
通过透射电镜、JC-1染色、ATP与NAD+/NADH检测，研究人员发现GWD改善线粒体肿胀与嵴破坏，提高红绿荧光比即线粒体膜电位（ΔΨm），升高ATP含量与NAD+/NADH比值，表明GWD改善MF小鼠线粒体结构与生物能量功能。
3.4. Network pharmacology analysis of GWD-containing serum
研究人员从GWD含药血清鉴定133个吸收成分，预测479个靶点并与1199个MF靶点取交集得99个共享靶点，GO与KEGG富集显示靶标集中于线粒体膜电位调节、氧化应激、AMPK信号通路等，提示GWD吸收成分可能通过多靶点调控线粒体与能量代谢。
3.5. Transcriptomic analysis highlighted mitochondrial homeostasis-related pathways associated with GWD treatment
转录组分析显示GWD组与模型组相比有694个上调与1319个下调基因，富集于脂肪酸代谢、AMPK信号、PPAR信号、线粒体自噬、TCA循环等，表明GWD转录水平调控与线粒体稳态相关通路。
3.6. Proteomic analysis highlighted mitochondrial homeostasis-related pathways associated with GWD treatment
蛋白质组分析显示GWD组有420个上调与619个下调蛋白，富集于有氧呼吸、电子传递链、ATP合成、脂肪酸β氧化、AMPK信号、氧化磷酸化等，表明GWD蛋白水平改变与线粒体稳态及能量代谢相关。
3.7. Integrated transcriptomic and proteomic analysis
研究人员将转录组与蛋白质组整合，Venn与九象限分析显示两者正相关（Pearson相关系数0.4614），重叠靶标富集于线粒体组织、ATP代谢、AMPK信号、脂肪酸降解、TCA循环等，进一步支持GWD通过调控线粒体相关通路发挥作用。
3.8. GWD restored mitochondrial homeostasis by activating the AMPK/PGC-1α pathway in MF mice
通过免疫组化与Western blot，研究人员发现GWD增加NRF1、TFAM表达，提高p-AMPKα/AMPKα、PGC-1α、MFN2（mitofusin-2），降低p-DRP1（Ser616）/DRP1，表明GWD通过激活AMPK/PGC-1α通路恢复线粒体稳态并调控线粒体融合分裂动态。
3.9. Inhibition of AMPK partially abolished the protective effects of GWD in MF mice
研究人员用Compound C抑制AMPK后发现，GWD改善的EF、FS、CK-MB、NT-proBNP、ATP与NAD+/NADH等效应被部分抵消，表明AMPK激活至少部分介导GWD的心脏保护与生物能量改善效应。
3.10. AMPK inhibition attenuated GWD-mediated restoration of mitochondrial homeostasis in MF mice
通过Western blot与qPCR，研究人员发现Compound C减弱GWD对p-AMPKα/AMPKα、PGC-1α、MFN2、p-DRP1（Ser616）/DRP1及Ppargc1a、Nrf1、Tfam、Mfn2 mRNA的上调或下调作用，进一步支持AMPK介导GWD恢复的线粒体稳态。
3.11. Molecular docking and molecular dynamics revealed potential interactions between GWD bioactive compounds and AMPK
研究人员对6个代表性吸收成分做分子对接，均显示与AMPK良好结合亲和力，其中槲皮苷（quercitrin）结合能最强（?10.3 kcal/mol），100 ns分子动力学显示槲皮苷-AMPK复合物稳定，为GWD活性成分与AMPK潜在相互作用提供计算证据。
讨论部分总结：研究人员指出MF不仅是ECM沉积结果，也与细胞能量代谢及线粒体功能紊乱密切相关，ISO诱导的MF伴随典型线粒体结构与功能异常。整合多组学一致富集AMPK、PPAR、氧化磷酸化、线粒体生物发生等通路。研究人员选择AMPK验证因其统筹线粒体生物发生、质量控制与能量感知，GWD激活AMPK伴随PGC-1α、NRF1、TFAM、MFN2上调及膜电位、ATP、NAD+/NADH恢复，Compound C部分取消上述效应，提示AMPK激活参与GWD诱导的线粒体适应与稳态维持。研究人员也指出局限：仅用雄性小鼠、Compound C可能有脱靶、未检测ACC磷酸化、具体主导活性成分需进一步验证。
结论部分翻译：总之，本研究表明GWD有效减轻异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）诱导的心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF），至少部分通过恢复线粒体稳态实现。转录组与蛋白质组分析连同药理学验证表明，AMPK/PGC-1α信号通路可能参与GWD的线粒体保护与抗纤维化效应。这些发现为线粒体稳态参与MF进展提供了支持证据，并凸显线粒体调控作为GWD抗纤维化效应的潜在机制。
