《Advanced Science》：Inhibition of IGFBP4 in Granulosa Cells Improves Reproductive Performance and Maintains Fertility With Age via YAP Signaling
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卵巢衰老是影响生殖能力和整体健康的关键因素。颗粒细胞（granulosa cells, GCs）在卵泡发生中发挥重要作用；然而，GC功能障碍导致卵巢衰老的机制仍不完全清楚。在本研究中，研究人员鉴定出胰岛素样生长因子结合蛋白4（insulin-like grow
卵巢衰老是影响生殖能力和整体健康的关键因素。颗粒细胞（granulosa cells, GCs）在卵泡发生中发挥重要作用；然而，GC功能障碍导致卵巢衰老的机制仍不完全清楚。在本研究中，研究人员鉴定出胰岛素样生长因子结合蛋白4（insulin-like growth factor binding protein 4, IGFBP4）是卵巢功能的负调控因子，在老年食蟹猴卵巢的GCs中表达上调。利用Igfbp4-HA标记小鼠模型，研究人员发现GCs中IGFBP4的表达在卵泡发育过程中增加，并在老年小鼠中进一步升高。对Igfbp4缺陷GCs的RNA-seq分析揭示了YAP（Yes-associated protein）通路的激活，该通路支持卵泡发育。机制上，IGFBP4减少GCs中YAP的核定位，从而抑制下游YAP靶基因表达和GC增殖。在Amhr2-Cre; Igfbp4fl/fl小鼠中，GC特异性敲除Igfbp4增强了卵泡发生，增加了窝产仔数并随年龄维持了生殖性能。在老年女性和早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency, POI）患者的GCs中也检测到IGFBP4水平升高。此外，在POI患者的卵泡液中观察到更高浓度的IGFBP4，支持其作为卵巢功能障碍生物标志物的潜力。这些发现确立了IGFBP4作为GC来源的卵巢功能抑制因子，并作为在衰老过程中维持卵巢功能的潜在靶点。
论文解读
**研究背景、问题与目的**
卵巢是哺乳动物中最早经历功能性衰老的器官之一，导致雌性生殖能力下降并最终进入绝经期。卵巢功能衰退不仅影响生殖健康，还加速全身衰老，增加心血管疾病、糖尿病、骨质流失和骨折等多种年龄相关疾病的风险。尽管医学进步延长了人类寿命，但卵巢功能持续时间基本保持不变，同时针对年龄相关女性不孕症的干预需求逐渐增加。然而，卵巢衰老的分子机制仍不完全清楚。
卵巢卵泡是女性生殖的基本功能单位，由卵母细胞和周围的颗粒细胞（granulosa cells, GCs）组成。GCs通过产生必需激素和旁分泌因子（如抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone, AMH）、KIT配体（KITL）、C型利钠肽（CNP）、胰岛素样生长因子1（IGF1）、血管内皮生长因子（VEGF）、骨形态发生蛋白6（BMP6）、垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）和血管活性肠肽（VIP））在卵泡生长和卵母细胞成熟中发挥关键作用。GCs过度或失调的凋亡可触发卵泡闭锁，导致卵巢储备耗竭。鉴于GCs在卵泡发生和卵巢稳态中的核心作用，研究人员聚焦于GCs以定义与年龄相关的转录变化和卵巢衰老机制。
IGF信号通路对发育、代谢和细胞增殖至关重要。IGF1通过与胰岛素样生长因子受体（IGF1R）结合激活下游信号，其活性受胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）调控。IGFBP4作为IGFBPs家族成员，已报道可抑制IGF诱导的调节性T淋巴细胞诱导，并具有IGF非依赖性作用，如通过抑制β-catenin信号促进心肌细胞分化。IGF信号通路在卵巢卵泡发育中也起关键作用，GCs表达IGF1和IGF1R，IGF1R对GC存活至关重要。反刍动物研究显示，小分子IGFBPs（包括IGFBP4）在排卵前卵泡中减少，而在闭锁卵泡中增加，提示IGFBPs可能参与卵泡闭锁，但IGFBP4在GC功能及卵巢衰老中的具体作用仍不清楚。YAP（Yes-associated protein）是Hippo通路的关键效应器，是GC增殖和卵泡发育的重要调节因子。
本研究旨在通过比较幼年和老年食蟹猴卵巢的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，鉴定GCs中与年龄相关的转录变化，重点关注IGFBP4，并探讨其在GC功能、卵泡发育及生殖衰老中的作用机制，以及临床相关性。
**主要关键技术与方法**
研究人员利用公开的食蟹猴卵巢scRNA-seq数据（GSE130664）进行差异表达分析，鉴定GCs中IGFBP4上调。通过CRISPR/Cas9构建Igfbp4-HA敲入小鼠模型，用于体内IGFBP4表达定位。采用Amhr2-Cre介导的GC特异性Igfbp4条件敲除小鼠（Amhr2-Cre; Igfbp4
fl/fl）进行功能验证。对Igfbp4敲低的原代小鼠GCs进行RNA-seq及KEGG富集分析，结合iRegulon转录因子预测，识别YAP通路。通过免疫荧光、Western blot和EdU掺入实验检测YAP定位、磷酸化及细胞增殖。临床样本来自54名接受卵母细胞获取的女性患者（包括年轻对照组、老年对照组和早发性卵巢功能不全（POI）组），通过qPCR和ELISA检测IGFBP4表达及卵泡液浓度。
**研究结果**
**2.1 IGFBP4在老年卵巢和闭锁卵泡中高表达**
通过重新分析幼年和老年食蟹猴卵巢scRNA-seq数据，研究人员发现IGFBP4在老年GCs中显著上调。在Igfbp4-HA小鼠模型中，免疫荧光显示IGFBP4在幼年小鼠的次级和窦状卵泡中表达，并在老年小鼠中进一步增强；IGFBP4阳性GCs常伴有核固缩、碎裂等凋亡形态，且所有HA阳性卵泡均为TUNEL阳性，表明IGFBP4表达与卵泡闭锁密切相关。
**2.2 IGFBP4抑制颗粒细胞增殖**
在人颗粒细胞样肿瘤细胞系KGN中，外源添加IGFBP4蛋白以剂量依赖性方式抑制细胞增殖（降低细胞数量和EdU阳性率），而shRNA介导的IGFBP4敲低则促进增殖。在原代小鼠GCs中得到一致验证，证实IGFBP4负调控GC增殖。
**2.3 IGFBP4抑制颗粒细胞中YAP信号通路**
对Igfbp4敲低的原代小鼠GCs进行RNA-seq，KEGG分析显示Hippo信号通路显著富集，iRegulon预测TEAD1（YAP主要转录因子）为最高评分调节因子。YAP靶基因（Ankrd1、Ctgf、Cyr61）在Igfbp4敲低后上调。免疫荧光显示，Igfbp4敲低减少GCs中YAP的细胞质定位，而IGFBP4短时刺激增加YAP细胞质定位并促进YAP磷酸化。在CKO小鼠中，GCs的YAP磷酸化水平降低，细胞质YAP信号比例减少，YAP靶基因表达上调，表明IGFBP4通过抑制YAP核定位减弱YAP信号活性，从而抑制GC增殖。
**2.4 敲除Igfbp4促进卵泡发生并增强生殖性能**
8周龄CKO小鼠的原始、初级和次级卵泡数量显著增加，闭锁卵泡减少，黄体增多；12月龄CKO小鼠的次级卵泡仍显著增多，闭锁卵泡减少，黄体增多。持续交配实验显示，CKO雌鼠在3-8个月和9-14个月两个年龄段的平均窝产仔数均显著高于对照组，且累积产仔数在11-13个月出现显著差异。血清激素检测显示，CKO小鼠的卵泡刺激素（FSH）水平在年轻和年老时均显著降低，抗米勒管激素（AMH）水平在年轻组显著升高，年老组有升高趋势，表明IGFBP4缺失改善卵巢内分泌功能，维持生育力。
**2.5 老年女性和POI患者中IGFBP4表达升高**
分析已发表的人类卵巢scRNA-seq数据，发现老年女性（47-49岁）GCs中IGFBP4表达显著高于年轻女性（18-28岁）。在临床队列中，>40岁女性GCs的IGFBP4 mRNA水平显著高于≤35岁组。POI患者GCs中IGFBP4表达显著升高，卵泡液IGFBP4浓度也显著高于对照组，且与血清AMH水平呈负相关，提示IGFBP4可作为卵巢功能障碍的生物标志物。
**总结与讨论**
本研究通过整合非人灵长类动物、小鼠模型和人类临床样本，揭示了IGFBP4作为GC来源的卵巢功能负调控因子，通过抑制YAP信号通路（减少YAP核定位及下游靶基因表达）来抑制GC增殖，促进卵泡闭锁，加速卵巢衰老。GC特异性敲除Igfbp4可增强卵泡发生、减少闭锁、提高窝产仔数并维持年龄相关生育力。临床数据显示IGFBP4在老年女性和POI患者中表达升高，且卵泡液浓度与AMH负相关，提示其作为POI候选生物标志物的潜力。研究结论总结如下：总之，我们的体外和体内研究结果将IGFBP4确定为GC功能的关键调节因子，并通过调节YAP亚细胞定位和下游YAP靶基因表达，成为卵巢衰老的潜在贡献者。通过整合食蟹猴的转录组分析、Amhr2-Cre介导的Igfbp4条件敲除小鼠的功能验证以及人类患者样本的临床数据，我们的研究提供了将IGFBP4与年龄相关卵巢功能障碍联系起来的跨物种证据。这种多模型方法增强了我们发现的转化价值，并支持IGFBP4作为POI等疾病候选生物标志物的潜力。然而，仍存在若干问题：尽管卵泡闭锁常与GC凋亡相关，但体外数据未显示IGFBP4具有一致的直接促凋亡效应；Igfbp4缺失对卵母细胞质量（包括染色体完整性和线粒体功能）的直接效应尚需明确；Igfbp4缺失对下丘脑-垂体-卵巢轴稳定性和代谢稳态等全身生理的更广泛影响也有待进一步研究。此外，需阐明IGFBP4的上游调控因子、其在生殖寿命中的表达动态以及药物靶向的可行性。这些发现为开发基于IGFBP4的策略以减轻年龄相关生殖性能下降和生育力维持奠定了基础。
