3D打印多材料微结构中的可控肽捕获与释放

《Advanced Science》：Controlled Peptide Capture and Release in 3D-Printed Multimaterial Microstructures

　　

高分辨率双光子激光打印（two-photon laser printing, 2PLP）已经在多种材料中革新了复杂三维微纳结构的制造。然而，将工程化生物分子作为功能性、刺激响应单元的应用仍未被充分探索。在本研究中，研究人员提出了一种制备3D打印水凝胶微结构的方法，该微结构含有从头设计（de novo）的异源二聚体卷曲螺旋（coiled-coil, CC）肽，以实现可控的肽捕获与释放。将一条卷曲螺旋链共价整合到3D打印网络中，并结合互补链的荧光标记。通过控制卷曲螺旋的组装与解组装，研究人员能够利用各种外部刺激，如pH、离子强度、温度或肽竞争物，实现选择性结合及随后的可编程释放。使用一组正交卷曲螺旋肽，研究人员制备了多材料微结构，在其中实现了空间分辨的卷曲螺旋功能化。在完全时空控制下，互补卷曲螺旋链能够被选择性地捕获和释放。该工作首次证明了离散折叠、可化学合成的肽可用于2PLP制造。利用卷曲螺旋相互作用作为分子手柄，能够制备刺激响应性和可重构的水凝胶微结构。这种方法为动态生物材料、可编程药物递送以及微尺度生化过程工程开辟了可能性。

**论文解读：基于卷曲螺旋肽的3D打印多材料微结构实现可控肽捕获与释放**

**研究背景与问题**
近年来，高分辨率双光子激光打印（2PLP）技术极大地推动了复杂三维微纳结构的制造，尤其是在软材料领域。然而，现有研究多聚焦于材料本身的形状或体积响应，而将工程化生物分子（如折叠肽和蛋白质）作为智能响应单元的应用仍十分有限。尽管简单序列功能肽（如RGD细胞黏附肽）或大分子组装体（如胶原网络）已被用于3D打印，但离散折叠的、具有高度特异性响应行为的肽类尚未被充分利用。卷曲螺旋（CC）肽是一类经过充分研究的寡聚肽组装体，其序列-结构-稳定性关系明确，可设计为异源二聚体，在温和条件下实现高选择性组装与解组装。然而，将此类离散折叠的合成肽整合到2PLP制造的3D微结构中，以实现可控的肽捕获与释放，此前尚未被报道。本研究的目的是开发一种含CC肽的光聚合墨水，通过2PLP打印水凝胶微结构，利用CC的组装与解组装实现时空可控的肽捕获与释放，并探索多材料结构的正交功能化。该论文发表在《Advanced Science》。

**关键技术方法**
研究人员采用双光子激光打印（2PLP）技术，以聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）和丙烯酰胺（AAm）为交联单体，锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸锂（LAP）为光引发剂，配制含丙烯酰胺修饰的CC肽a（浓度为10 mM）的墨水。肽链通过固相肽合成制备，CC肽b通过N-末端荧光染料（如TAMRA、荧光素、Cy5.5）标记。使用正交CC肽对（设计自Gradi?ar等）实现多材料功能化。捕获与释放过程通过荧光显微镜和共聚焦显微镜进行表征，通过监测荧光强度变化评估肽结合与释放效率。

**研究结果**
**2.1 用于可控肽捕获与释放的墨水设计**
研究人员通过优化墨水配方（34.8 wt.% PEGDA，31.1 wt.% AAm，3 wt.% LAP，31.1 wt.%水），提高了水凝胶微结构对肽b的渗透性。打印的环状结构（直径50 μm，壁厚8 μm，高6 μm）在100 μM肽b溶液中浸泡15分钟即可实现均匀捕获。通过对比含肽1a与不含肽的参考结构，证实了选择性捕获依赖于CC相互作用。研究人员进一步测试了不同刺激对释放的影响：在pH 3、2 M NaCl或75°C条件下，30分钟内几乎完全释放1b；添加3 M盐酸胍（GdnHCl）可在5分钟内完全释放，且捕获-释放过程可逆循环至少三次；添加1 mM游离竞争肽1a可在10分钟内通过竞争交换实现释放，同样可逆循环。这些结果表明，CC的静电和疏水相互作用被破坏时，捕获的肽可快速释放。

**2.2 用于空间分辨肽捕获的多材料微结构**
研究人员使用正交CC对（CC2、CC3、CC4，分别对应肽2a/2b、3a/3b、4a/4b），通过依次更换含不同CC肽a的墨水，打印了包含四个区域（无肽、2a、3a、4a）的多材料微结构（如环阵列、数字编码圆柱、3D网格）。将含三种荧光标记肽b（2b、3b、4b）的混合溶液（100 μM）浸泡30分钟后，共聚焦显微镜显示各肽仅被捕获到其互补CC肽a所在的区域，无交叉反应（off-target）。3D重构证实肽在微结构内完全扩散。使用乱序序列的对照肽（2b-S、3b-S、4b-S）未观察到捕获，进一步验证了CC形成的特异性。此外，在功能化与非功能化区域交界处未观察到明显的肽扩散泄漏。

**2.3 多材料微结构中的正交肽释放**
研究人员聚焦于竞争介导的释放策略，以实现选择性释放。通过背景扩散测试发现肽3b释放最快，其次为4b，最慢为2b。因此，按CC3→CC4→CC2的顺序进行竞争释放：使用1 mM游离肽4a（作为CC3的竞争物）可近乎完全释放3b，而2b和4b保持结合；随后添加1 mM游离肽4a竞争物仅释放4b，2b保留；最后添加1 mM游离肽2a竞争物释放2b。尽管存在少量背景扩散导致的非特异性荧光损失（尤其CC4），但通过提高竞争物浓度至10 mM或添加1 M GdnHCl可加速释放并减少损失。温度控制释放（55°C）因CC对在打印材料中的熔解温度差异不明显而未能实现选择性。

**总结与结论**
本研究首次证明离散折叠的化学合成肽可作为2PLP制造微结构的功能单元。通过含丙烯酰胺修饰的CC肽a的墨水打印的3D微结构，能够通过CC相互作用选择性地捕获互补肽b，且无特异性吸附。在温度、pH、离子强度、竞争物或变性剂等刺激下，捕获的肽可快速释放，且该过程可逆循环多次。利用三组正交CC肽对，实现了多材料微结构中肽捕获与释放的完全时空控制。论文结论部分指出，该制造系统是首个将离散折叠合成肽整合到2PLP材料的案例。通过将CC的选择性组装特性从溶液转移至3D打印材料，展示了刺激诱导的捕获与释放的巨大潜力。除荧光标记外，其他功能分子（如肽、蛋白质、核酸、小分子）可通过化学修饰连接，实现可编程的药物递送、微反应器设计、可回收传感系统或亲和分离平台。该平台具有完全生物正交性，为动态生物材料和微尺度生化过程工程开辟了新途径。