《Journal of Food Composition and Analysis》：Dominant fungi during pile-fermentation of Ya’an Tibetan dark tea: comparative effects of representative strains on non-volatile constituents and taste characteristics
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研究人员对雅安藏黑茶这一代表性中国黑茶的真菌ITS扩增子测序及六个发酵阶段的非靶向代谢组学进行分析，结合共现与代谢物关联分析，鉴定出Thermomyces、Aspergillus、Debaryomyces、Rhizomucor及Mortierella为核心优势
研究人员对雅安藏黑茶这一代表性中国黑茶的真菌ITS扩增子测序及六个发酵阶段的非靶向代谢组学进行分析，结合共现与代谢物关联分析，鉴定出Thermomyces、Aspergillus、Debaryomyces、Rhizomucor及Mortierella为核心优势属。随后研究人员采用代表性菌株对原料黑茶进行单菌固态发酵，并结合理化、代谢组及定量描述分析（QDA）感官评价开展研究。结果显示，Aspergillus显著消耗酯化与非酯化儿茶素，提高水浸出物含量与“厚度”感，形成更饱满、苦味更弱的茶汤；Rhizomucor则较好保留儿茶素，产生更强、涩感更明显的滋味；Debaryomyces与Mortierella生成最高的茶褐素（TBs）含量及最深的汤色。这些结果证明了上述测试菌株在标准单菌培养条件下对品质的差异化影响，并为后续在确定性真菌群落中的验证提供了候选菌株。
研究背景方面，雅安藏黑茶是中国六大茶类之一黑茶的典型后发酵代表，历史上作为南路边茶销往西藏及周边高寒缺菜膳食区，具有红褐汤色、醇厚陈香及调节血脂、改善代谢与肠道健康等潜在功能。其品质核心形成于微生物驱动的渥堆发酵过程，该过程在约85%含水率、堆中64℃、相对湿度25至42%下持续约24至35天，构成典型的湿热加微生物发酵体系。现有高通量测序虽揭示不同黑茶各具微生物指纹，如Fu砖茶以Aspergillus、Candida、Cyberlindnera为主，Liubao茶富集Aspergillus、Penicillium、Eurotium cristatum及Sphongomonas，熟普以Aspergillus、Penicillium、Rhizopus、Saccharomyces为优势，Qingzhuan砖茶早期以Lichtheimia、Helicocarpus为主、中期出现Rasamsonia、Talaromyces等嗜热真菌演替，但针对雅安藏黑茶核心真菌功能及其对非挥发性滋味成分转化的定量比较仍缺乏标准化对照研究。自然渥堆为开放动态微生态系统，原料、季节、车间菌源、堆形及翻堆加水差异导致批次波动，难以区分菌属或菌株特异性效应，因此需在统一原料与工艺条件下开展单菌平行比较以明确主导真菌的转化能力。
研究人员采用两阶段策略开展研究：首先通过对工业渥堆六个阶段样品的真菌ITS扩增子测序与非靶向代谢组学表征真菌演替与代谢物动态，整合相对丰度、阶段判别模式及真菌相关网络连通性筛选候选优势属；其次选用同一原料黑茶（YC，2024年8月四川雅安名山131一芽三四叶初制毛茶，来自英台茶厂）、统一接种量105 CFU/mL与3% v/w及标准化单菌固态发酵程序，分别接入Aspergillus niger、Rhizomucor pusillus、Thermomyces lanuginosus、Mortierella elongata、Debaryomyces hansenii进行28天恒温恒湿培养（相对湿度90%，温度参照英台茶厂传统工艺曲线），随后通过常规感官评价、定量描述分析（QDA）、主要滋味相关成分靶向测定及非靶向液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）代谢组学进行定量评估。研究发现五属真菌Thermomyces、Aspergillus、Debaryomyces、Rhizomucor、Mortierella在雅安藏黑茶渥堆中兼具高丰度、阶段判别性及共现网络核心节点特征，被选作代表菌株开展比较。
主要关键技术方法包括：以雅安英台茶厂工业渥堆六个时间点样本（YC、G1至G5）开展真菌内部转录间隔区（ITS）扩增子环一致构测序（CCS）与非负挥发物非靶向代谢组学；基于Spearman共现网络、线性判别分析效应大小（LEfSe）与韦恩整合筛选优势属；采用同一灭菌原料在恒定温湿度程序下进行单菌固态发酵；依据GB/T 23776-2018开展专业评审团常规感官评价与六属性QDA；按国标与改良法测定水浸出物、茶多酚、总游离氨基酸、咖啡因、可溶性糖及高效液相色谱（HPLC）定量儿茶素、没食子酸、氨基酸组成；以UPLC–MS/MS进行非靶向代谢物提取与峰校正、注释及正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、主成分分析（PCA）、KEGG通路富集等多元统计。
研究结果部分保留原文小标题简述如下：
3.1 筛选优势真菌属。研究人员对六个渥堆阶段样品进行真菌ITS测序与非靶向代谢组学，获得平均单样58,602条CCS读长，注释349个真菌属。早期G1多样性最高（Chao1=441.44±6.45，Shannon=2.87±0.003），成品G5最低（Chao1=92.17±6.51，Shannon=0.97±0.0056）。相对丰度大于1%的11个高丰度属包括Aspergillus、Cercophora、Mortierella、Rhizomucor、Schizothecium、Thermoascus、unclassified_Sordariales、Thermomyces、Debaryomyces、Cladosporium、Setophoma。Spearman共现网络（|ρ|>0.5，P<0.05）显示19节点64边，Curvularia与Mortierella为高中连节点。LEfSe识别33个阶段判别属（LDA>2.0，P<0.05），其中14属至少出现在两阶段。整合高丰度集、判别集与共现核心集后，Thermomyces、Aspergillus、Debaryomyces、Rhizomucor、Mortierella五属在三类集合中重叠或全覆盖，被选为候选优势属并选取种级代表菌株。
3.2 单菌固态发酵藏黑茶感官评价。研究人员对五株代表菌发酵样与原料YC开展常规感官与QDA评价。发酵后干茶由黄绿转深褐，香气由栗香转陈香烘烤香，滋味更醇和。Debaryomyces组香气得分最高（82.03），陈香最显；Aspergillus组滋味最饱满厚实（83.57），总分最高（82.07），Debaryomyces（81.27）次之，Mortierella最低（79.25）。Lab色度显示Aspergillus组b最低（9），汤色最暗红；YC最亮（L*=67）。QDA显示YC苦涩显著高于所有发酵组，发酵有效降低苦涩；Aspergillus与Thermomyces保留相对较高苦味评分；Aspergillus厚度显著最高，与较高水浸出物一致；Thermomyces与Mortierella酸味显著较低。
3.3 单菌固态发酵滋味相关成分变化。水浸出物以Aspergillus最高（35.58%），顺序为A>M>D>T>R>YC（28.77%）。可溶性糖Mortierella最高（3.65%），Aspergillus次之（3.40%）。茶多酚YC最高（13.06%），单菌组9.20%至12.00%，Thermomyces、Mortierella、Rhizomucor较高，Aspergillus最低（9.20%）。总游离氨基酸YC最高（37.34 mg/g），Aspergillus（16.23 mg/g）显著高于其余发酵组，Thermomyces最低（12.95 mg/g）。咖啡因变化较小（2.90%至3.44%）。色素方面，YC的茶黄素（TFs）（0.18%）与茶红素（TRs）（2.69%）最高；单菌组TRs显著降低，Aspergillus与Thermomyces保留较高TRs（1.80%、1.74%）；茶褐素（TBs）单菌均显著升高，Mortierella最高（3.58%），Debaryomyces次之（3.52%），Aspergillus最低。儿茶素总量YC最高（89.28 mg/g），Rhizomucor保留最高（62.17 mg/g），Aspergillus降解最强（31.90 mg/g），酯型与非酯型均大幅减少；没食子酸（GA）普遍上升，Aspergillus因产单宁酶水解酯型儿茶素致GA升高。游离氨基酸中茶氨酸YC最高，Aspergillus降幅最大至3.02 mg/g（约YC的18.7%），苦味氨基酸Thermomyces最低（4.41 mg/g），Aspergillus氨基酸总体消耗最少。
3.4 单菌发酵藏黑茶非挥发性代谢物非靶向谱。全局注释4010种非挥发性代谢物，以氨基酸及其衍生物（811）、有机酸（750）、苯环类化合物（485）为主。PCA中PC1与PC2解释46.00%与16.40%方差，YC与单菌组沿PC1分离，Aspergillus独立聚类，Debaryomyces与Mortierella靠近YC，扰动相对较小。OPLS-DA模型R2Y=0.997，Q2=0.872，筛选VIP>1.5的差异代谢物91个，52个显著富集于Aspergillus组，含有机酸、氨基酸衍生物、苯环类与黄酮类。k均值聚为8簇，簇8为YC特有如原花青素C1、天竺葵素-3-O-阿拉伯糖苷；簇1为发酵上调尤其在Aspergillus与Debaryomyces如2-甲基柠檬酸。Aspergillus差异代谢物最多（1687个）且独有207个，Mortierella最少（521个）。KEGG显示Rhizomucor富集戊糖与葡萄糖醛酸相互转化、各种生物碱生物合成；Aspergillus富集各种生物碱生物合成、聚酮糖单元生物合成、苯丙素生物合成；Debaryomyces富集核苷酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成；Mortierella富集氨基酸生物合成、氨酰-tRNA生物合成（多下调）；Thermomyces富集戊糖与葡萄糖醛酸相互转化、各种生物碱生物合成、维生素B6代谢。关键通路中戊糖与葡萄糖醛酸相互转化在Aspergillus、Debaryomyces、Thermomyces、Rhizomucor上调，Aspergillus积累双半乳糖醛酸、丙酮酸、D-葡萄糖醛酸；脂肪酸生物合成与不饱和脂肪酸途径在Rhizomucor与Aspergillus上调，积累FFA(16:0)、FFA(16:1)、FFA(18:1)、FFA(18:2)；各种生物碱生物合成在所有单菌组富集，L-苯丙氨酸、L-色氨酸、strictosidine下调，水杨酸、分枝酸、2-氨基苯甲酸、喜树碱上调。研究人员指出单菌体系无法复现工业堆中菌群演替、互作与梯度，YC仅作未发酵基线且无非匹配自然渥堆对照，所用商业菌株非茶堆分离亦未作食品安全评估，结论应视为限定条件下菌株效应而非自然品质决定证据。
讨论部分总结指出，研究人员通过整合真菌ITS扩增子测序、非靶向代谢组学与单菌固态发酵，在雅安藏黑茶渥堆中确认Thermomyces、Aspergillus、Debaryomyces、Rhizomucor、Mortierella五属兼具高丰度与质量关联及网络核心特征，并在统一基质与工艺下量化比较其转化差异：Aspergillus对非挥发性代谢物影响最强，显著降解酯型与非酯型儿茶素、提升水浸出物与厚度感，茶汤更饱满；Rhizomucor保留最高总儿茶素，滋味较强涩；Debaryomyces与Mortierella产最高茶褐素（TBs）与最深汤色，具醇厚口感。结果为后续采用茶堆分离株及确定多菌株发酵剂优先筛选候选菌提供依据。同时研究人员强调简化单菌体系不能复制自然微生物互作与环境异质性，且缺工艺匹配自然发酵对照，故不得将单菌效应等同于工业品质形成机制，所用菌株未作产毒致病评估，仅作实验代表而非食品批准发酵剂，未来需结合分离株、自然对照与多菌株组合验证。
研究结论部分翻译如下：在本研究中，研究人员整合真菌ITS扩增子测序、非靶向代谢组学与单菌固态发酵，以探究雅安藏黑茶渥堆发酵过程中优势真菌及其对品质形成的潜在贡献。在黑茶系统中已有报道的五属真菌Thermomyces、Aspergillus、Debaryomyces、Rhizomucor及Mortierella，在雅安藏黑茶渥堆发酵中也表现为高丰度或具阶段判别性。本研究的主要贡献在于对代表菌株进行标准化并行比较，揭示了其对儿茶素转化、游离氨基酸、水浸出物及茶色素的差异化影响。Aspergillus组对非挥发性代谢物影响最强，显著降解酯型与非酯型儿茶素，水浸出物含量最高且“厚度”评分最高，茶汤明显更饱满。Rhizomucor组保留最高总儿茶素含量，而Debaryomyces与Mortierella组表现出最高水平的茶褐素（TBs），产生深红汤色与厚重口感。这些发现为后续采用茶堆分离株及确定多菌株发酵剂评估候选菌株提供了比较依据。然而，简化的单菌体系无法复现自然渥堆中的微生物互作与环境异质性。此外，由于YC仅代表未发酵原料基线且未纳入工艺匹配的传统渥堆对照，本研究结果不能确立单菌处理与自然混合微生物发酵的差异或近似程度。因此，所观察到的变化应解释为限定实验条件下的菌株特异性效应，而非任何单一真菌独立控制工业品质形成的证据。本研究未对所用五种真菌菌株开展专门的菌株级食品安全评估。尽管这些物种曾在黑茶或其他发酵相关环境中被报道，其出现并不能证明此处检测的特定菌株安全。因此应将菌株视为实验代表而非食品批准发酵剂。在考虑将其应用于食品发酵前，需对其产毒与致病潜力及发酵产物中相关微生物代谢物进行全面评估。
