孢子被膜效应子对非典型粘蛋白的颠覆阻断果蝇细胞免疫

《Advanced Science》：Subversion of Atypical Mucin Traps by a Spore-Coat Effector Blocks Cellular Immunity in Drosophila

　　

尽管已有少数昆虫病原真菌（如罗伯茨绿僵菌 Metarhizium robertsii）的效应子被证实能逃避昆虫体液免疫，但真菌颠覆宿主细胞防御的策略仍不清楚。研究人员在此报道了罗伯茨绿僵菌中一种孢子被膜蛋白Eac1的鉴定，该蛋白对真菌感染果蝇属（drosophilids）至关重要，但对感染毛虫并非必需。Eac1靶向Sgf1（spore gluing factor，孢子粘合因子），Sgf1在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中与它的成簇同源物Sgf2相互作用。Sgf1和Sgf2均为果蝇属特有的分泌蛋白，此前功能未知。与Sgf2不同，Sgf1在果蝇属中呈斑块状分布，且似乎是Sgf2的复制产物。真菌感染后，这两个基因均通过Toll通路被诱导表达。研究人员证实Sgf1和Sgf2是小型非典型粘蛋白（atypical mucins），能结合真菌细胞壁成分并通过形成胶体样凝胶基质来捕获孢子；然而，这种捕获作用可被Eac1破坏。果蝇的Sgf1、Sgf2尤其是双突变体的缺失突变株，其对抗真菌定殖的能力显著受损。研究结果表明，非典型粘蛋白的孢子捕获是有效血细胞封装的前提，并揭示了真菌寄生虫如何部署专门的被膜蛋白来逃避宿主细胞免疫。

该研究背景在于，当前对于昆虫病原真菌如何规避宿主细胞免疫的机制认知尚存空白，现有研究多聚焦于体液免疫逃逸，而细胞免疫层面的效应子作用机制不明。鉴于细胞免疫先于体液免疫发生且在抗真菌中起关键作用，明确真菌与宿主细胞免疫的互作分子基础具有重要科学意义。研究人员以此开展研究，旨在鉴定真菌中靶向果蝇细胞免疫的关键毒力因子，并解析宿主对应的防御分子及其演化关系，最终揭示真菌效应子与宿主非典型粘蛋白互作以逃逸免疫的分子机理。该研究发表于《Advanced Science》。

为开展研究，研究人员主要采用以下关键技术方法：利用酵母双杂交（yeast two-hybrid, Y2H）系统筛选黑腹果蝇免疫挑战cDNA文库以鉴定真菌效应子Eac1的宿主互作靶点；应用CRISPR-Cas9基因编辑技术在果蝇中构建Sgf1、Sgf2及双突变体；通过反向转录定量PCR（RT-qPCR）分析基因表达模式及通路依赖性；运用蛋白质pull-down与免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, co-IP）验证蛋白互作；采用体外孢子凝集实验与扫描电镜观察粘蛋白介导的凝胶基质形成；利用体内活体成像（intravital microscopy）与真菌负荷测定评估突变果蝇的细胞免疫缺陷；结合系统发育基因组分析探究Sgf1/Sgf2在果蝇属中的分布与演化；样本涵盖黑腹果蝇野生型及Toll通路突变株（如Tl^KG03609、Dif¹、MyD88^c03881等），以及多种果蝇属物种（如D. simulans、D. suzukii等）和昆虫宿主（蜡蛾、家蚕）。

研究结果如下：

2.1 Spore Surface-Localized Eac1 is a Virulence Factor Against Drosophila。研究人员通过荧光定位确认Eac1为罗伯茨绿僵菌分生孢子及血腔菌丝体细胞表面定位的GPI锚定蛋白，其在成熟分生孢子中表达最高。表型实验表明ΔEac1突变体对雌果蝇致死率显著降低，过表达株毒力增强，但对蜡蛾和家蚕幼虫无显著影响，且在罗伯茨绿僵菌近缘种中特异存在，转入球孢白僵菌（Beauveria bassiana）可提升其对果蝇毒力，证明Eac1是特异性针对果蝇的毒力因子。

2.2 Eac1 Interacts With a Drosophila Factor Required for Antifungal Immunity。Y2H及后续pull-down、co-IP验证Eac1与果蝇分泌蛋白CG34054（命名为Sgf1）特异性互作。Sgf1受Toll通路（Tl、MyD88、Dif、spz）调控诱导表达，不受Imd通路影响。CRISPR敲除Sgf1的果蝇对罗伯茨绿僵菌和球孢白僵菌易感性显著增加，真菌负荷升高，证实Sgf1参与抗真菌防御。

2.3 Sgf1 Interacts With its Neighboring Gene to Jointly Fight Fungal Infection。Y2H显示Sgf1与相邻基因CG30026（命名为Sgf2）互作且二者均能自聚，而Eac1不与Sgf2互作但能在酵母三杂交（Y3H）中抑制Sgf1自聚及Sgf1-Sgf2互作。Sgf2同样受Toll通路诱导。单独敲除Sgf2或双敲除Sgf1/Sgf2均使果蝇抗真菌感染能力严重受损，且Sgf1防御作用大于Sgf2。

2.4 Gene Duplication and Patchy Distribution。系统发育分析表明Sgf2广泛存在于果蝇属，Sgf1仅见于东方谱系（Oriental lineage）约14个物种，为由Sgf2复制而来的新基因（约33 MYA）。不同果蝇物种感染实验显示ΔEac1对所有含Sgf2或Sgf1的果蝇毒力均下降，表明Eac1功能具有广谱针对性。结构预测显示二者C端具相似β-折叠，Sgf1-C与Eac1互作。

2.5 Sgf1 And Sgf2 Are Mucin-Like Proteins。尽管长度小于300 aa且非糖基化，Sgf1（161 aa）和Sgf2（228 aa）富含脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸（PTS）及半胱氨酸，N端无序、C端形成三股β-折叠，具粘蛋白特征但不典型（atypical mucins）。去糖基化实验证实其未被糖基化修饰，C端结构类似于II型几丁质结合域（type-2 chitin binding domains, ChBDs）。

2.6 Entrapment of Fungal Spores by Sgf1 and Sgf2。体外结合实验显示Sgf1/Sgf2能结合β-1,3-葡聚糖（curdlan）、肽聚糖（peptidoglycan, PGN）和几丁质（chitin），Eac1仅结合几丁质。Sgf1/Sgf2在体外能将罗伯茨绿僵菌和球孢白僵菌分生孢子胶凝成团形成胶体样基质，该过程依赖半胱氨酸二硫键且被Eac1阻断；但不凝集血腔菌丝体（hyphal-body）和非致病烟曲霉（Aspergillus fumigatus）孢子，也不凝集细菌。

2.7 Differential Immune Responses of Mutant Flies to Fungal Challenge。体内实验显示Sgf1、Sgf2及双突变果蝇血腔中真菌孢子未被有效捕获，大量菌丝体细胞增殖，真菌负荷显著高于野生型w¹¹¹⁸。突变体血淋巴酚氧化酶（phenoloxidase, PO）活性各异。AMP（antimicrobial peptides）基因Drs、BaraA在双突变体中下调，但Sgf1/2不直接调控AMP表达。过表达Sgf1/Sgf2提升果蝇存活率，其细胞免疫缺陷程度与TEP1-4缺失突变体（TEPq^Δ）相当，且Sgf1/2在eater¹和TEPq^Δ中上调，提示补偿效应。

讨论部分总结：研究人员讨论指出Eac1作为孢子表面GPI锚定蛋白通过结合Sgf1阻断非典型粘蛋白介导的结节形成（nodulation），其仅存在于绿僵菌属且对果蝇特异。Sgf1由Sgf2复制而来（约33 MYA vs 69 MYA），在东方谱系果蝇中因真菌选择压发生功能分化，Sgf1防御作用更强。虽非糖基化但富PTS和半胱氨酸的Sgf1/Sgf2被定义为非典型粘蛋白，其C端具类ChBD结构介导孢子捕获，但不能捕获菌丝体可能因细胞壁重塑降低β-葡聚糖暴露及Eac1遮蔽。多孢子共捕获机制此前未被发现，鳞翅目利用不同蛋白（如Noduler）捕获，提示分类学差异。Eac1靶向Sgf1及可能通过空间掩蔽抑制Sgf2体现了病原与宿主的基因对基因（gene-for-gene）军备竞赛。细胞免疫因子Eater、TEPs与Sgf1/2可能存在功能互补。

研究结论部分翻译：在这项工作中，研究人员鉴定了罗伯茨绿僵菌完全毒力所必需的孢子表面蛋白Eac1。Eac1结合Sgf1但不结合Sgf2。Sgf1和Sgf2均为黑腹果蝇成簇基因编码的非典型粘蛋白，特异性存在于果蝇属，其中Sgf1可能起源于Sgf2的复制。这两种蛋白各自自聚并相互互作，表现出结合细胞壁成分和成胶活性以捕获真菌孢子；然而其功能可被细胞表面Eac1有效阻断。有趣的是，Sgf1和Sgf2不凝集非致病性真菌烟曲霉的分生孢子、非致病性真菌孢子、细菌细胞以及昆虫体腔内形成的罗伯茨绿僵菌菌丝体细胞。果蝇中的基因破坏及后续感染实验显示，Sgf1、Sgf2单独的突变体，尤其是双突变体，在防御真菌感染方面显著受损。数据表明，果蝇非典型粘蛋白对多个真菌孢子的捕获是血细胞介导的封装/结节形成和黑化（melanization）的关键步骤。孢子表面蛋白在真菌感染与免疫逃逸界面起重要作用。本研究鉴定的GPI锚定Eac1位于分生孢子和菌丝体细胞表面，阻断宿主非典型粘蛋白介导的结节化。Eac1仅存在于绿僵菌属且仅在感染果蝇而非蜡蛾和家蚕幼虫时需要毒力， Caterpillar中缺乏同源靶基因可能解释了这一点。Sgf1和Sgf2均未归类为粘蛋白因其长度低于300 aa cutoff，实验证明虽非糖基化但均富PTS、含多个半胱氨酸且具还原剂可破坏的成胶特征，故为非典型粘蛋白样蛋白。二者结合真菌细胞壁成分并捕获罗伯茨绿僵菌和球孢白僵菌分生孢子，因C端含假定碳水化合物结合样结构域。ΔEac1孢子更易被凝集，但野生型和过表达Eac1孢子仍可被捕获，提示孢子表面Eac1量不足以完全抵消凝集活性；菌丝体细胞不被凝集可能因细胞壁重塑及Eac1涂层。体内实验显示Sgf1/Sgf2缺失突变体缺陷孢子封装和真菌定殖防御，但突变体在真菌挑战后存活和PO活性差异显著，提示功能非完全等效或冗余，未捕获孢子触发更强黑化具毒性。Eac1靶向Sgf1而后者结合Sgf2，二者凝集功能被Eac1颠覆反映军备竞赛演化。ΔEac1突变体在仅含Sgf2的D. suzukii和D. virilis中也感染受损，Eac1可能作为孢子表面掩蔽蛋白阻断Sgf2介导结合而非直接互作。并行生存数据显示eater¹果蝇对绿僵菌最易感，Sgf1/2^Δ2与TEPq^Δ相似，证实Eater、TEPs及Sgf1/2在抗真菌中均关键且可能具补偿作用。总之，研究人员鉴定了一个颠覆果蝇非典型粘蛋白捕获的真菌孢子被膜蛋白，增进了对昆虫细胞免疫及病原与宿主军备竞赛的理解。