过氧化氢和羟基自由基在细胞焦亡和癫痫中的同步成像

《Advanced Science》：Synchronized Imaging of Hydrogen Peroxide and Hydroxyl Radical in Pyroptosis and Epilepsy

　　

实时可视化活体系统中的氧化应激在癫痫研究中构成巨大挑战，主要是因为缺乏能够高特异性区分结构相似的活性氧物种（ROS）的工具。在此，研究人员提出了一种双功能荧光探针HH，能够通过不同的识别机制独立检测过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（•OH），产生光谱分辨的信号，具有高灵敏度、高选择性和良好的生物相容性。HH能够在gasdermin介导的细胞焦亡和戊四氮（PTZ）诱导的癫痫细胞模型中实现高分辨率、无干扰的氧化还原动力学成像。此外，HH成功应用于PTZ诱导的斑马鱼和海人酸（KA）诱导的小鼠癫痫模型，揭示癫痫样条件下ROS水平升高。值得注意的是，靶向ROS的治疗干预显著调节了氧化谱，展示了HH在治疗评估中的潜力。这项工作不仅填补了ROS生物学和癫痫研究中关键的方法学空白，也为研究神经炎症和炎症性疾病中的氧化还原调控以及开展机制和治疗研究提供了一个多功能平台。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
癫痫是全球最常见的难治性神经系统疾病之一，影响超过7000万人，以反复自发性发作为特征，严重损害生活质量并增加神经退行性变、精神共病和猝死风险。尽管研究深入，但癫痫的分子发病机制仍不明确，因其病因异质且多因素。近年来，gasdermin介导的细胞焦亡（一种促炎性程序性细胞死亡）被认为与癫痫及中枢神经系统（CNS）病理（如缺血性卒中、创伤性脑损伤）的发生发展相关。氧化应激是该病理轴的关键驱动因素，其中活性氧（ROS），特别是过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（•OH），在触发神经炎症、线粒体功能障碍和神经元丢失中起核心作用。H₂O₂是相对稳定且可扩散的ROS，在生理条件下作为氧化还原信号的第二信使；但病理应激下其过度积累破坏氧化还原平衡，促进脂质过氧化，使神经元易受损。H₂O₂参与Fenton反应产生•OH——最具反应活性和细胞毒性的ROS之一，无差别氧化核酸、脂质和蛋白质。尽管H₂O₂和•OH具有重要生物学意义，但在活体系统中实现其实时、空间分辨检测仍具技术挑战，尤其是在细胞焦亡和癫痫病理中两者的时空相互作用尚不清楚，主要原因是缺乏能在复杂生物环境中同时、选择性、实时监测的合适化学工具。

**研究内容与意义**
为克服上述局限，研究人员合理设计了一种双功能荧光探针HH，整合了两种正交识别基序：芳基硼酸酯用于选择性检测H₂O₂，以及羟基化芳香单元响应•OH。反应后，HH生成两种结构不同的香豆素衍生物，分别具有独立、不重叠的荧光发射，可在活细胞和动物中实现H₂O₂和•OH的同时、无干扰检测，具有高时空分辨率。该研究在系列体外和体内模型中验证了HH的生物学效用：首先监测gasdermin介导的细胞焦亡过程中的ROS动态，揭示与细胞死亡相关的氧化特征；随后在两种常用癫痫模型（PTZ诱导的斑马鱼和KA诱导的小鼠模型）中可视化发作过程中H₂O₂和•OH的实时氧化激增。值得注意的是，治疗性调节氧化还原稳态可改变探针读数，表明HH作为治疗评估和机制探索分子工具的潜力。这项工作不仅填补了ROS生物学和癫痫研究中的关键方法学空白，也为神经炎症、神经退行性疾病和氧化性疾病研究奠定了更广泛应用基础。论文发表在《Advanced Science》。

**主要关键的技术方法**
研究人员设计并合成了双功能荧光探针HH，采用香豆素衍生物作为荧光骨架，引入四氢喹喔啉和五元吡咯烷环以增大斯托克斯位移和荧光亮度，并引入甲基酯基改善水溶性和脂溶性。HH包含两个正交识别机制：•OH触发芳香羟基化及随后的环化生成绿色荧光产物HH-1；H₂O₂诱导硼酸酯氧化脱保护后环化生成红色荧光产物HH-2。通过紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、高分辨质谱（HRMS）和核磁共振（NMR）表征探针及反应产物。在体外系统评估了HH对H₂O₂和•OH的光学响应、动力学、灵敏度、选择性和响应机制。在细胞实验中，利用HeLa和SH-SY5Y细胞系进行共聚焦成像，检测外源性和内源性ROS，并利用LPS/PMA刺激、ROS清除剂（NAC、TEMPO、催化剂、甘露醇、DMSO）验证选择性。在细胞焦亡模型中，使用DM-αKG诱导HeLa细胞焦亡，并用Z-VAD-FMK、CAT、TEMPO抑制或清除ROS。在癫痫细胞模型中，使用PTZ处理SH-SY5Y细胞，并评估CUR、RES、PHE、GAB等药物的治疗效果。在动物模型中，建立PTZ诱导的斑马鱼慢性癫痫模型和KA诱导的小鼠急性癫痫模型，通过IVIS成像系统实时监测脑内ROS动态，并进行离体成像和组织学分析（苏木精-伊红染色、尼氏染色）。斑马鱼和BALB/c裸鼠来源已注明。

**研究结果**
**2.1 双响应荧光探针的设计与合成**：研究人员合理设计并合成了单分子双响应探针HH，基于香豆素骨架，引入四氢喹喔啉和吡咯烷环增强光学性能，并整合•OH触发芳香羟基化环化（生成HH-1，绿色荧光）和H₂O₂触发硼酸酯氧化脱保护环化（生成HH-2，红色荧光）两种正交机制，两种产物的发射峰相距106 nm，有效避免光谱串扰。所有中间体和最终产物经¹H NMR、¹³C NMR、红外光谱和HRMS确认。

**2.2 体外表征**：光谱测量显示，HH与H₂O₂反应后，在598 nm处产生21倍荧光增强（Φ=0.05）；与•OH反应后，在492 nm处产生超过180倍荧光增强（Φ=0.09）。发射峰分离超过100 nm，可实现双通道无干扰检测。动力学实验表明，•OH反应在15分钟内饱和，H₂O₂反应在30分钟内饱和。剂量-响应实验显示，HH对•OH的检测限（LOD）为4.9 nM，线性范围0–40 μM（R²=0.9936）；对H₂O₂的LOD为18.6 nM，线性范围0–100 μM（R²=0.9960）。选择性实验表明，HH对•OH和H₂O₂具有高度选择性，其他生物相关物种（ClO^-、¹O₂、O₂^•-、NO、ONOO^-、GSH、金属离子、氨基酸等）几乎无响应。

**2.3 响应机制验证**：通过合成模型化合物并与HH反应产物进行光谱比较，以及HRMS分析，证实•OH触发芳香羟基化随后分子内环化生成HH-1，H₂O₂触发硼酸酯氧化脱保护后环化生成HH-2，两种机制正交且独立。

**2.4 双通道细胞成像**：MTT实验显示HH在50 μM以下对HeLa和SH-SY5Y细胞无明显细胞毒性。在细胞成像中，HH单独孵育显示微弱荧光；外源H₂O₂或•OH刺激后，分别显著增强红色或绿色荧光，且被相应清除剂（NAC或TEMPO）抑制。LPS/PMA刺激同时增强双通道荧光，表明内源性ROS共生成。在细胞焦亡模型中，DM-αKG处理导致时间依赖性的双通道荧光增强（4 h和8 h时绿色通道增强1.7和2.6倍，红色通道增强1.2和2.2倍），Z-VAD-FMK、CAT、TEMPO处理可抑制相应通道信号，证实H₂O₂和•OH积累与细胞焦亡进程密切相关。

**2.5 活细胞癫痫模型中监测•OH和H₂O₂动态及治疗干预评估**：在PTZ处理的SH-SY5Y细胞中，随着PTZ浓度增加（0.1、0.3、0.5 mM），双通道荧光强度呈剂量依赖性升高，流式细胞术验证一致。药物治疗实验显示，CUR、RES、PHE、GAB处理后，H₂O₂和•OH水平均显著降低，表明这些药物的抗癫痫作用部分归因于ROS清除或氧化通路调节。

**2.6 动物模型实时监测**：在PTZ诱导的斑马鱼慢性癫痫模型中，随PTZ处理时间延长，脑部双通道荧光逐渐增强。在KA诱导的小鼠急性癫痫模型中，尾静脉注射HH后，癫痫小鼠脑部荧光信号比正常小鼠更快速且更强，立体定位注射至海马亦得到一致结果。离体成像显示脑部荧光信号真实，H&E染色表明HH无组织损伤或炎症，具有良好的生物相容性。

**总结与讨论**
研究结论：研究人员开发了一种双响应荧光探针HH，用于在复杂生物系统中同时、选择性检测H₂O₂和•OH。该分子设计利用独特的•OH芳香羟基化机制和H₂O₂识别的硼酸酯基团，结合氰基的位置特异性环化产生两种不同荧光输出。所得探针具有优异的光学性能、高选择性和灵敏度，以及低细胞毒性，可在活细胞和体内模型中进行可靠的实时ROS成像。HH已成功应用于监测gasdermin介导的细胞焦亡中H₂O₂和•OH的动态变化，揭示ROS积累与焦亡严重程度之间的强相关性。此外，HH在癫痫样细胞和动物模型（包括PTZ诱导的斑马鱼和KA诱导的小鼠模型）中实现了H₂O₂和•OH的双通道成像。据研究人员所知，很少有荧光探针被报道用于癫痫相关模型中H₂O₂和•OH的双通道成像。这些发现支持氧化应激参与癫痫相关病理，并表明HH是探索氧化还原相关分子过程的有用工具。此外，HH在评估候选抗癫痫药物的抗氧化功效方面显示出潜力，适用于治疗筛选应用。总的来说，这项工作不仅为探索神经系统疾病中的ROS动态提供了多功能成像策略，也为研究H₂O₂和•OH在炎症、神经退行性变和治疗干预中的更广泛作用开辟了新途径。