慢性卒中小鼠模型中人皮层类脑体移植的活体多模态成像研究

《Advanced Science》：Intravital Multimodal Imaging of Human Cortical Organoid Transplantation in a Mouse Model of Chronic Stroke

　　

慢性卒中会导致持久的神经功能缺损，而基于人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell, hiPSC）衍生的皮层类脑体（Cortical Organoid, CO）的实验策略仍受限于缺乏纵向活体移植物监测工具。研究人员在此介绍了类脑体追踪多模态成像平台（Multimodal Imaging Platform for Organoid Tracking, MIPOT），其整合了磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）、生物发光成像（Bioluminescence Imaging, BLI）、手术显微镜和活体双光子荧光显微镜（intravital Two-Photon Fluorescence Microscopy, TPFM），以监测小鼠慢性卒中病灶内CO的移植情况。MIPOT能够确认清理后的梗死腔内初始移植物放置位置，纵向评估与活力相关的生物发光信号，并高分辨率可视化移植物衍生细胞及短期细胞动态。生物发光成像显示移植物相关信号进行性下降，两周时稳定在约25%，而终点组织学证实后期时间点人源移植物衍生细胞的持久性有限。综上，MIPOT为损伤脑内类脑体移植监测提供了多模态框架，并为未来优化移植物存活、成熟及宿主-移植物整合提供支持。

该研究针对慢性卒中导致永久神经功能缺损且现有治疗策略效果不佳的临床难题，以及人诱导多能干细胞衍生的皮层类脑体移植研究中缺乏纵向活体监测工具、既往研究多聚焦急性或亚急性卒中而慢性期移植动态行为不明的现状，研究人员建立了类脑体追踪多模态成像平台（MIPOT），在慢性卒中小鼠模型中整合手术显微镜、MRI、BLI与TPFM实现移植物的多尺度纵向监测。研究发现移植物在术后早期填充梗死腔但活力迅速下降，两周时仅存约25%初始信号，四周时皮质区内人源细胞持久性有限，同时证实去除缺血核心可提供相对清洁的整合界面，DTI显示移植物-宿主界面存在各向异性分数升高，TPFM可实现亚细胞分辨率下移植物细胞形态与报告基因表达的在体观察。该研究发表于《Advanced Science》，所建立的MIPOT框架为慢性卒中类脑体治疗的在体评估提供了关键技术支撑，明确了早期移植脆弱窗口与后续优化方向。

为开展研究，研究人员主要采用以下关键技术方法：使用3至4个月龄雄性C57BL/6J小鼠，通过玫瑰红（Rose Bengal, RB）光血栓法诱导运动皮层局灶性梗死，10天后形成伴胶质瘢痕的慢性卒中模型；建立MIPOT平台，集成术中显微镜、9.4T高场MRI（含T2加权与扩散张量成像DTI）、BLI及TPFM四种模态；通过慢病毒转导hiPSC构建Luc2-mCherry双报告系统与ICam多色荧光及核定位GCaMP6s标记系统；开发可移除3D打印塑料适配器与头bar固定系统以实现同一动物跨模态顺序成像；采用免疫荧光人特异性抗原STEM121与核标记Ku80进行终点组织学验证。

研究结果部分如下：

2.1 Multimodal Imaging Platform for Peri- and Post-Transplantation Tracking of COs。研究人员建立MIPOT整合四种互补活体成像模态，在围移植期（移植前后约一周）监测慢性缺血脑内人iPSC衍生CO，分为单模态（MRI评估位置与填充、BLI测活力、TPFM看形态）与跨模态（结合颅窗与适配器顺序成像）两种模式，终点辅以组织学验证，实现移植物动态评估。

2.2 Generation of iPSC-COs and their Transplantation for the Treatment of Chronic Stroke。研究人员通过双SMAD抑制与延长分化方案生成具皮层特征的CO，第56天表达Tuj1，第80天形成CTIP2与SATB2层状结构；慢性卒中模型10天证实GFAP+胶质瘢痕形成；通过手术显微镜下吸除坏死梗死组织形成清洁腔隙，将D56 CO四分后分步注入腔内部署移植。

2.3 In Vivo MRI Monitoring of Transplanted COs。研究人员用9.4T MRI在移植后-3、1、14天采集T2加权像，Day1移植物呈明显T2高信号，Day14边界模糊且信号显著下降（p=0.0002），体积约0.54至1.78 mm³均值1.0 mm³；DTI显示Day14移植物-宿主界面分数各向异性（Fractional Anisotropy, FA）升高；MRI与STEM121组织学配准确认T2低信号区对应密集核团且人细胞较少区域。

2.4 Longitudinal Tracking of the Viability of Transplanted COs Through BLI。研究人员用Luc2+mCherry hiPSC衍生CO进行BLI，所有动物Day1均见局部高于背景信号，信号进行性下降至Day10后稳定，Day14保留约25%初始信号；终点STEM121与mCherry共标证实存活人源细胞；体外标准曲线与终点BLI-组织面积正相关验证BLI作为活力读取的可靠性。

2.5 Labeling and High-Resolution Two-Photon Imaging iPSC-COs。研究人员用ICam载体系统（mCherry、TagBFP、iRFP682分别偶联H2B-GCaMP6s）进行单色与混色标记，体外TPFM可见核G6s与胞质荧光及二次谐波（Second Harmonic Generation, SHG）信号；移植后14天在体TPFM清晰识别移植物内mCherry+与GCaMP6s+细胞，见厚纤维样SHG结构，短期时序追踪见细胞位移微小且H2B-GCaMP6s强度波动但无一致钙瞬变。

2.6 A Removable 3D-Printed Head-Fixation System Enables Same-Animal MRI, BLI, and TPFM。研究人员开发两组件3D打印塑料头固定系统（颅部适配器与可拆卸头bar），避免金属不兼容MRI；同一动物可先去头bar做MRI与BLI，再装头bar做TPFM；代表性动物Day4见高T2信号与强BLI通量4.39×10⁷光子/s，Day14 T2信号降、BLI降至0.90×10⁷光子/s（降79.4%），TPFM见表层血管与稀疏荧光细胞，终点Ku80与STEM121确认存活人细胞。

2.7 Histology Evaluation of Implanted COs in Chronic Stroke。研究人员在移植后2周与4周取材，STEM121证实皮质移植物区有人源细胞持久性有限；4周时TUJ1与STEM121共标重叠少，神经元标记表达有限；少数动物（4/14）意外见移植物细胞至海马区，部分呈突起样形态与TUJ1表达，但属非计划观察不作定量结论。

讨论部分总结：研究人员指出MIPOT首次在慢性卒中腔模型中整合手术显微镜、MRI、BLI与TPFM，揭示CO移植早期约10天内活力急剧下降至约25%并趋于稳定，符合移植脆弱窗口；4周皮质区人源细胞持久性有限，较发育或非损伤脑环境更差；去除缺血核心提供清洁界面但需权衡风险，所有动物初始MRI确认移植物位于腔内；既往多依赖单模态或终点组织学，MIPOT提供跨尺度读取；高场MRI早期捕捉结构变化与DTI界面FA升高，组织学配准解释T2低信号；BLI量化存活动态定义干预窗口；TPFM见SHG可能源于胶原或血管化，可重识别细胞但未见稳健钙活动；同一动物跨模态需报告基因负担权衡；局限包括类脑体分割移植的力学应激、环孢素A免疫抑制、观察窗仅2至4周、缺血管与功能报告及行为学、少数海马意外病例仅描述；MIPOT可扩展至其他移植场景。

研究结论部分翻译：在本研究中，研究人员建立了类脑体追踪多模态成像平台（MIPOT），能够对移植到慢性卒中病灶的人iPSC衍生CO进行纵向多尺度评估。通过结合术中显微镜、高场MRI、BLI和TPFM，MIPOT使研究人员能够确认初始移植物放置、纵向监测活力相关信号动态以及活体内移植物衍生细胞的高分辨率可视化。研究人员观察到CO移植物在递送后立即填充病灶腔，但在前约10天内活力迅速下降，到第2周时仅约四分之一的初始细胞存活。这种早期下降与先前报道一致，即血管化类脑体在宿主灌注建立前的10至14天内会发生收缩。移植后4周，在皮质中仍可检测到少量人源移植物衍生细胞，表明在慢性损伤环境中移植细胞的持久性有限，该环境比先前类脑体移植研究中发育中或非既往损伤啮齿动物脑更为恶劣。总之，我们的工作为慢性卒中病灶中类脑体移植物的围移植期追踪建立了多模态框架，并确定了关键的技术与生物学挑战，包括移植物持久性有限以及需要改进策略以支持长期存活与成熟。