《Veterinary Research》：In vitro and in vivo studies of GAPLINC identify it as a critical host factor involved in the regulation of influenza A virus infection
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尽管先前的研究提示GAPLINC在调控甲型流感病毒（IAV）感染中发挥作用，但GAPLINC在体外和体内IAV感染中的功能参与仍 largely 未知。本研究发现，lncRNA GAPLINC的表达被包括PR8、WSN、H3N2和H9N2在内的数种IAV毒株感
尽管先前的研究提示GAPLINC在调控甲型流感病毒（IAV）感染中发挥作用，但GAPLINC在体外和体内IAV感染中的功能参与仍 largely 未知。本研究发现，lncRNA GAPLINC的表达被包括PR8、WSN、H3N2和H9N2在内的数种IAV毒株感染显著下调。有趣的是，其他几种病毒如伪狂犬病病毒（PRV）、仙台病毒（SeV）和单纯疱疹病毒（HSV）的感染也导致GAPLINC表达的显著降低。在IAV感染期间，NF-κB及其下游IL-6/STAT3信号通路的激活至少部分促进了GAPLINC表达的下调。宿主细胞中GAPLINC的敲低抑制了病毒复制，而GAPLINC的过表达则增加了病毒滴度。进一步采用杂合GAPLINC敲除（KO）小鼠（GAPLINC+/-）和纯合GAPLINC KO小鼠（GAPLINC-/-）来确定其体内功能。GAPLINC敲除使小鼠比野生型小鼠对IAV感染更具抵抗力，表现为较低的病毒载量和肺损伤、较慢的体重下降和改善的生存率。研究人员证实GAPLINC明显抑制IAV感染细胞中IRF3的激活。此外，研究人员注意到抑制ATG7参与的自噬减弱了GAPLINC的促病毒活性。总之，这些结果支持GAPLINC通过靶向IRF3和ATG7介导的自噬通路在增强IAV致病性中发挥关键作用的结论。
**论文解读**
甲型流感病毒（IAV）属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），是引起人类和多种动物急性呼吸道疾病的主要病原体，对全球公共卫生构成严重威胁。IAV的复制效率不仅依赖于其自身聚合酶复合物（PB1、PB2、PA），还受到宿主因子（包括非编码RNA）的复杂调控。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸且缺乏蛋白质编码能力的RNA分子，可通过表观遗传调控、信号通路调节等多种机制参与病毒复制和抗病毒免疫应答。近年来研究揭示，IAV感染可诱导宿主细胞中数千种lncRNA的表达发生显著变化，其中部分lncRNA（如AVAN、IFITM4P、lnc-ISG20）通过调节先天免疫发挥抗病毒作用，而另一些（如MxA、NSPL、TSPOAP1-AS1）则被病毒劫持以促进自身复制。然而，lncRNA在病毒-宿主互作中的具体功能及其调控病毒致病性的精确机制仍有待阐明。
GAPLINC（胃腺癌预测长基因间非编码RNA）是一种长基因间非编码RNA，其同源序列仅在人、某些灵长类和小鼠中保守。已有研究表明，GAPLINC在胃癌、肺癌和结直肠癌等多种恶性肿瘤中显著上调，并通过ceRNA网络、信号通路调控和表观遗传修饰等多种机制调节肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。此外，GAPLINC在巨噬细胞中作为负调控因子，其缺失可上调基础炎症基因并增强内毒素休克小鼠模型的抵抗力。然而，GAPLINC在IAV感染及抗病毒免疫应答中的功能参与仍知之甚少。基于前期研究发现ATG7（自噬相关基因7）在IAV-宿主互作中发挥关键调控作用，且ATG7敲除细胞的RNA-seq分析提示GAPLINC可能是ATG7促进IAV复制的关键调节因子，本研究旨在通过体外和体内实验系统阐明GAPLINC在IAV感染中的表达变化、功能角色及潜在分子机制。该研究发表于《Veterinary Research》。
**主要关键技术方法概述**（不超过250字）
研究人员采用以下关键技术：① 细胞培养与病毒感染：使用人肺泡上皮细胞（A549）、人胚肾细胞（HEK293T）、犬肾细胞（MDCK）和宫颈癌细胞（HeLa），均购自美国模式培养物保藏中心（ATCC）；病毒包括IAV毒株PR8、WSN、H3N2、H9N2以及伪狂犬病病毒（PRV）、仙台病毒（SeV）和单纯疱疹病毒（HSV），其中PR8通过反向遗传学拯救，WSN和SeV由中国科学院George F. Gao实验室提供，H9N2毒株A/Chicken/Fujian/MQ01/2015为本实验室分离株；② 稳定细胞系构建：利用慢病毒表达系统建立GAPLINC敲低和过表达A549细胞系，以及持续激活STAT3的细胞系；③ 动物模型：使用C57BL/6J背景的野生型、GAPLINC杂合敲除（GAPLINC
+/-）和纯合敲除（GAPLINC
-/-）小鼠（5-6周龄，购自Gempharmatech），经鼻内接种病毒进行体内实验；④ 分子检测：qRT-PCR、RT-PCR、western blotting、血凝试验（HA）、空斑形成试验（PFA）以及组织病理学分析；⑤ 细胞分级分离：核质分离测定GAPLINC亚细胞定位；⑥ 病毒附着与内化测定：低温结合和酸性甘氨酸缓冲液处理区分病毒附着和内化阶段。
**研究结果**
**Viral infections downregulate the expression of GAPLINC in vitro and in vivo**
通过qRT-PCR和western blotting检测发现，IAV PR8、WSN、H3N2、H9N2感染A549细胞后，GAPLINC表达显著下调，且呈剂量和时间依赖性；此外，SeV、PRV和HSV感染同样导致GAPLINC下调。小鼠体内实验显示，PR8感染后肺组织GAPLINC表达降低，且基底表达在各组织间存在差异。
**IL-6/STAT3 signaling regulates the expression of GAPLINC**
poly I:C（双链RNA模拟物）和LPS（脂多糖）处理A549细胞可下调GAPLINC表达；NF-κB抑制剂BAY11-7082预处理可逆转病毒诱导的GAPLINC下调。IL-6刺激显著降低GAPLINC表达，而IL-6受体抑制剂托珠单抗则增加其表达。表达持续激活STAT3（STAT3
D661V）的细胞中GAPLINC水平降低，而STAT3敲低细胞中GAPLINC表达升高并能部分阻断病毒诱导的下调，表明NF-κB/IL-6/STAT3信号轴负调控GAPLINC表达。
**Knockdown of GAPLINC suppresses influenza virus replication**
在GAPLINC敲低的A549细胞中，IAV（PR8、WSN、H9N2、H3N2）和PRV感染后，病毒NP或gE的mRNA和蛋白水平显著降低，病毒滴度（HA和PFA测定）下降，细胞死亡（PI染色）减少，表明GAPLINC缺失抑制病毒复制。
**Overexpression of GAPLINC promotes viral replication**
GAPLINC过表达A549细胞中，IAV和PRV的复制显著增强，表现为病毒NP和gE表达升高、病毒滴度增加、细胞死亡增多，进一步证实GAPLINC的促病毒作用。
**GAPLINC facilitates influenza virus replication at a post-entry stage**
核质分离显示GAPLINC主要分布于细胞质。病毒附着和内化实验表明，GAPLINC敲低或过表达不影响IAV的附着和内化效率。但过表达GAPLINC显著增加病毒基因组RNA（vRNA）、互补RNA（cRNA）和mRNA的水平，而敲低则减少，提示GAPLINC在病毒进入后阶段促进RNA合成。
**Heterozygous GAPLINC knockout mice are resistant to IAV infection**
GAPLINC
+/-小鼠的GAPLINC表达在各组织部分降低。感染PR8、WSN、H9N2和PRV后，GAPLINC
+/-小鼠的肺病毒NP表达、病毒滴度显著低于野生型小鼠，且感染WSN后体重下降更慢、生存率更高。
**Homozygous GAPLINC knockout mice exhibit increased resistance to IAV infection**
GAPLINC
-/-小鼠完全缺失GAPLINC表达。感染PR8和WSN后，GAPLINC
-/-小鼠表现出更低的病毒NP表达、病毒滴度、肺组织病理损伤评分，以及更慢的体重下降和更高的生存率。H9N2和PRV感染也得到类似结果。直接比较WT、GAPLINC
+/-和GAPLINC
-/-小鼠，病毒NP水平呈梯度降低，表明GAPLINC缺失剂量依赖性地增强抗病毒能力。
**Regulation of IAV infection by GAPLINC is associated with cellular autophagy**
在GAPLINC敲低细胞中，IAV诱导的IRF3磷酸化水平显著升高，而过表达则抑制IRF3磷酸化，提示GAPLINC负调控IRF3激活。此外，GAPLINC敲低降低自噬标志物LC3-II并增加p62（SQSTM1）水平，过表达则促进自噬。自噬抑制剂氯喹（CQ）处理可消除GAPLINC过表达对病毒复制的增强作用。在ATG7敲低背景下，GAPLINC过表达对自噬和病毒复制的促进作用被减弱，表明GAPLINC的促病毒活性依赖于ATG7参与的自噬通路。
**讨论与结论**
讨论部分指出，GAPLINC在多种病毒感染后表达下调，与NF-κB/IL-6/STAT3信号轴的激活相关，提示炎症信号通路至少部分参与感染过程中GAPLINC的调控。功能上，GAPLINC发挥促病毒作用，在病毒进入后阶段促进复制，其机制至少部分涉及抑制IRF3激活和增强自噬。GAPLINC的下调可能代表一种宿主保护性防御机制，以限制病毒感染。此外，GAPLINC在癌症和病毒感染中的功能可能共享共同的分子机制。本研究确定lncRNA GAPLINC是增强IAV感染和致病性的重要宿主因子，其表达被IAV感染下调，且该下调与NF-κB/IL-6/STAT3信号轴激活相关。GAPLINC作为促病毒因子，在病毒进入后阶段促进复制，至少部分通过抑制IRF3激活和增强ATG7介导的自噬来实现。研究结果将GAPLINC定位为IAV感染的关键宿主调控lncRNA，病毒诱导的下调可能代表一种宿主相关的保护性反应，提示GAPLINC是抗病毒干预的潜在靶点。
