HIV-1衣壳粒的中央孔道有助于维持病毒衣壳的稳定性

《Journal of Molecular Biology》：The central pore of HIV-1 capsomers promotes sustained stability of the viral capsid

　　

摘要

HIV-1衣壳负责协调多种关键的进入后事件以促进感染，它由衣壳蛋白的六聚体和五聚体（即衣壳亚基）构成。这些衣壳亚基排列成封闭的圆锥形结构——即衣壳，用以保护病毒的RNA基因组以及复制酶逆转录酶和整合酶。每个衣壳亚基都包含一个中央孔道，该孔道周围环绕着带正电荷的氨基酸侧链——精氨酸-18和赖氨酸-25。R18和K25环通过与宿主多阴离子肌醇六磷酸结合来推动衣壳的组装，同时被认为能够促使dNTP进入衣壳，从而助力逆转录过程。本研究证明，R18环可以通过N21K替代而功能上被取代，这样在中央孔道内就会形成一个新的正电荷环。与以往研究中R18突变体无法在培养环境中存活不同，N21K替代有助于那些缺乏R18环的病毒突变体获得第二位点的补偿性突变，进而使其恢复接近野生型的适应性。通过对多个缺乏R18环的中央孔道突变体的比较分析发现，病毒颗粒的感染性并非与IP6结合或衣壳组装相关，而是与衣壳稳定性以及包括逆转录和核进入在内的关键进入后事件有关。我们的研究结果表明，中央孔道在衣壳的组装及其进入病毒细胞后的稳定性维持中起着至关重要的作用。

引言

HIV-1病毒颗粒的组装发生在受感染细胞质膜的内叶上。这一过程是由Gag多蛋白前体驱动的，它与GagPol多蛋白前体以约20:1的比例结合，形成一种球形晶格，即未成熟的Gag晶格。Gag的多聚化主要由其衣壳结构域驱动，当组装完成后，新生成的病毒颗粒会以未成熟病毒样颗粒的形式从细胞中释放出来。随着这些病毒样颗粒的释放，它们会经历成熟过程，在此过程中，作为GagPol组成部分的病毒蛋白酶会将Gag和GagPol前体切割成其成熟形式的各个结构域。最终阶段的成熟则表现为成熟的CA蛋白组装成封闭的圆锥形结构——即衣壳，该衣壳作为病毒核心的保护壳，包裹着病毒的RNA基因组以及逆转录酶和整合酶。病毒进入细胞后，衣壳依然保持稳定完整，它既是逆转录反应的场所，还会与宿主因子相互作用，协助病毒进入细胞核并实现DNA整合。

HIV-1衣壳主要由成熟的CA蛋白构成的六聚体晶格组成，大约包含250个六聚体以及恰好12个五聚体。CA蛋白以六聚体和五聚体两种形式几乎等量地组装，这两种结构统称为衣壳亚基，它们对于在成熟过程中形成封闭的衣壳至关重要。具体而言，衣壳晶格两端存在的五聚体“缺陷”能够促使晶格发生弯曲，从而形成衣壳特有的圆锥形结构。在高盐环境中，重组的CA蛋白会组装成完全由六聚体构成的螺旋管状结构。然而，在存在宿主多阴离子肌醇六磷酸的情况下，CA蛋白则会组装成含有五聚体的封闭式类似衣壳的颗粒，这类颗粒在大小和形状上都与真正的HIV-1衣壳相似。事实上，由于肌醇六磷酸有助于促进稳定衣壳的组装，因此它是HIV-1复制过程中的重要辅因子。此外，肌醇六磷酸还能通过与未成熟的Gag晶格结合并稳定其结构，使病毒颗粒中含有足够量的肌醇六磷酸，从而有助于在成熟过程中形成衣壳。

肌醇六磷酸通过与CA蛋白N端结构域中的两个氨基酸侧链——精氨酸-18和赖氨酸-25结合，来促进HIV-1衣壳的组装，这两个侧链在衣壳亚基的“中央孔道”内形成了带正电荷的环结构。R18环和K25环都能与单个肌醇六磷酸分子结合，通过中和中央孔道周围的正电荷，肌醇六磷酸能够稳定衣壳亚基。如果这些与肌醇六磷酸结合的残基发生突变，就会阻碍衣壳的正常组装，进而大幅降低病毒颗粒的感染性。与肌醇六磷酸能够在体外促进类似衣壳颗粒的组装这一事实相对应，有研究认为它在五聚体的形成过程中起着尤为重要的作用。K25位置的突变会阻止肌醇六磷酸在体外促进类似衣壳颗粒的组装，反而只会导致螺旋状的CA管状结构形成。此外，我们之前的研究还发现，通过第二位点的补偿性突变，可以恢复K25A类似衣壳颗粒在体外的组装能力以及病毒颗粒中封闭衣壳的组装，而这些补偿性突变很可能有助于五聚体的重新形成。除了与肌醇六磷酸结合外，中央孔道还会与dNTP结合，这一结合过程主要由R18驱动，这表明dNTP可能通过中央孔道传输，从而在封闭的衣壳内部促进逆转录反应的进行。

病毒进入细胞后，HIV-1衣壳保持最佳稳定性对于实现有效的感染而言极为重要。为了实现对病毒基因组的高效逆转录，需要一个封闭且稳定的衣壳，这样才能保护病毒核酸免受宿主先天免疫系统的识别，同时也能让逆转录酶始终与它的核酸底物保持接触。此外，稳定的衣壳还有助于病毒核心有效地与核膜结合、与核孔复合物相互作用，并顺利穿过核孔。病毒进入细胞核并完成逆转录后，病毒核心会开始解壳，这一过程表现为衣壳的解体，从而使病毒DNA释放出来，进而整合到宿主的染色质中。解壳的时机对于实现有效感染至关重要，如果由于衣壳稳定性下降而导致的过早解壳，就会妨碍逆转录、病毒进入细胞核以及DNA整合等过程的正常进行。肌醇六磷酸能够在体外稳定已形成的衣壳，不过它在细胞内稳定衣壳的作用则尚不明确。有一些研究表明，减少目标细胞中的肌醇六磷酸并不会干扰HIV-1的感染过程。相反，那些衣壳稳定性较低的CA突变体的感染性会在肌醇六磷酸浓度降低时显著下降，这说明肌醇六磷酸确实能在病毒进入细胞后稳定衣壳，但野生型HIV-1要完成有效的感染并不一定需要这种稳定作用。另有研究认为，肌醇六磷酸还在衣壳亚基的中央孔道中引导dNTP的进入过程中发挥作用。因此，尽管中央孔道及其与肌醇六磷酸的相互作用对衣壳的组装显然非常重要，但这种相互作用在病毒进入细胞后的作用机制，以及对衣壳稳定性、dNTP进入和逆转录过程的影响，目前还不十分清楚。

在本研究中，我们通过检测用新的正电荷环替代中央孔道中的R18环所带来的影响，来探究HIV-1衣壳亚基中央孔道的功能。我们发现，替代R18环有助于病毒获得第二位点的补偿性突变，从而显著恢复病毒的复制能力。通过对中央孔道的进一步研究以及对多个缺乏R18环的突变体的比较分析，我们发现，在这种情况下，病毒结合肌醇六磷酸以及在体外和病毒颗粒中组装衣壳的能力与病毒的感染性并无关联。不过，我们发现那些缺乏R18环且无法感染的中央孔道突变体在逆转录和核进入方面存在缺陷，而这些缺陷的根源在于衣壳稳定性不足。我们的研究结果表明，除了在衣壳组装中的作用已被充分证实之外，中央孔道还承担着在病毒进入细胞后维持衣壳稳定性的功能。

章节节选

衣壳六聚体中央孔道中的R18环可以被位于21位置的新正电荷环所替代

我们之前曾报道过，具有K25环缺失突变（K25A）的HIV-1突变体在传播过程中会获得第二位点的补偿性突变，从而使HIV-1能够重新组装出封闭的衣壳。然而，当我们尝试让具有R18突变的病毒体传播时，并没有观察到补偿性突变的出现。有趣的是，在体外组装实验中，R18和K25在衣壳组装过程中扮演着不同的角色，其中R18负责推动CA六聚体的形成，而K25则负责推动CA

NSK蛋白在体外和病毒颗粒中都能组装衣壳

虽然交联的六聚体有助于比较肌醇磷酸的结合情况，但无法用于评估突变对衣壳组装的影响。因此，我们采用了体外浊度测定法，并结合负染电子显微镜技术，来检测肌醇六磷酸是否能够促使LSK和NSK形式的CA蛋白组装成类似真实HIV-1衣壳在大小和形状上的封闭颗粒。我们将成熟的野生型、LSK型或NSK型的CA蛋白与5毫摩尔的肌醇六磷酸混合，然后进行测量

讨论

HIV-1衣壳晶格中的每个衣壳亚基都包含一个中央孔道，该孔道能够结合肌醇六磷酸，从而促进衣壳的组装。中央孔道还可以结合dNTP，据推测这些dNTP可以通过该孔道传递，进而使得衣壳内部能够进行DNA合成。这些结合过程是由位于中央孔道内缘的两个带正电荷的环——R18环和K25环——共同调控的。我们之前的研究得出了两项与当前研究相关的结果。首先，我们发现HIV-1无法

细胞

MT4和SupT1 T细胞系是从美国典型培养物收藏机构获得的，我们在罗斯威尔公园纪念研究所提供的含10%胎牛血清、2毫摩尔L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素以及100微克/毫升链霉素的RPMI 1640培养基中培养这些细胞。HEK 293T、HeLa以及TZM-bl细胞则是从美国典型培养物收藏机构或美国国立卫生研究院艾滋病试剂项目处获得，我们在添加了相同成分的Dulbecco改良Eagle培养基中培养这些细胞。此前已经描述过的293T亲本细胞以及IPPK基因敲除细胞

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文所述研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

Freed和Pathak实验室的研究工作得到了美国国家卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心内部研究计划的支持，同时也获得了美国国立卫生研究院艾滋病研究办公室的资助。参与这项研究的美国国立卫生研究院研究人员是在履行其作为联邦雇员的工作职责时开展工作的，这些工作符合该机构的政策要求，因此可视为美国政府的工作成果。不过，研究所得出的发现和结论

Alex B. Kleinpeter|Donna L. Mallery|Anna Albecka|Ryan C. Burdick|Nadine Renner|J.Ole Klarhof|Boglarka Vamos|Vinay K. Pathak|Leo C. James|Eric O. Freed

病毒-细胞相互作用研究组，HIV动态与复制项目，癌症研究中心，国家癌症研究所，美国马里兰州弗雷德里克市21702-1201