《Journal of Molecular Biology》：The role of SLC24A5 (NCKX5) in human skin pigmentation: the importance of cation transport activity
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摘要人类的色素沉着由黑素体的形成以及通过黑素生成作用产生的黑素决定，这一过程受黑素生成蛋白的调控。SLC24A5基因中存在一种单核苷酸多态性（A111T），该基因负责编码K?依赖型的Na?/Ca2?交换蛋白NCKX5，它是决定人类皮肤和虹膜颜色正常变异的重要因素。尽管有研究认为N
摘要
人类的色素沉着由黑素体的形成以及通过黑素生成作用产生的黑素决定，这一过程受黑素生成蛋白的调控。SLC24A5基因中存在一种单核苷酸多态性（A111T），该基因负责编码K?依赖型的Na?/Ca2?交换蛋白NCKX5，它是决定人类皮肤和虹膜颜色正常变异的重要因素。尽管有研究认为NCKX5与皮肤色素沉着有关，但其在黑素生成过程中的离子转运功能仍不清楚。为了解决这一问题，我们利用CRISPR/Cas9技术敲除有色人类MNT1黑色素瘤细胞中的SLC24A5基因。结果发现，失去NCKX5会导致真黑素水平显著下降，同时形成结构异常、不均匀且纤维结构有缺陷的黑素体。为评估NCKX5的功能作用，我们用带有myc标签的NCKX5变体重新构建了脱色细胞，其中包括转运功能有缺陷的D383N突变体。使用A111变体的NCKX5比T111变体更能有效恢复真黑素的合成，而D383N变体则无法恢复色素沉着。此外，在培养基中添加能中和细胞内器官酸性pH值的溶酶体靶向弱碱NH?Cl后，缺乏NCKX5的脱色细胞中的真黑素含量显著增加，这表明NCKX5在跨内质网网状结构中的Ca2?转运活动与黑素体pH值调节之间存在关联。我们还讨论了多种已报道的会影响人类（眼皮肤白化病或OCA6）和动物色素沉着的NCKX5突变体，以及它们对NCKX5介导的Ca2?转运活性的潜在影响。
引言
人类的色素沉着取决于皮肤、毛发和眼睛中黑素的沉积。在黑素细胞特有的称为黑素体的细胞器中会形成两种类型的黑素：棕黑色的真黑素和红黄色的褐黑素1, 2。真黑素与褐黑素的比例决定了色素沉着的表型。多个色素沉着相关基因共同调控着黑素体生成和黑素合成的复杂过程。麦角皮质激素1受体（MC1R）和阿古蒂信号蛋白（ASIP）负责调控哪种类型的黑素会被生成。而黑素体的形成与成熟则由PMEL、MATP、酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）和TYRP2来调控3, 4。负责黑素生成与分布的基因属于酪氨酸酶基因家族，其蛋白产物包括三种膜结合型的黑素体酶：酪氨酸酶（TYRase）、TYRP1和TYRP2。TYRase是色素生成途径中的关键酶，对于褐黑素体和真黑素体中的褐黑素及真黑素合成都至关重要。它能催化氨基酸L-酪氨酸两步转化为L-DOPA，然后再氧化为多巴醌（DQ）[5]。而TYRP1和TYRP2则主要参与真黑素体中的真黑素生成途径，它们能催化DQ转化为吲哚-5,6-醌及其羧酸衍生物，而且据推测它们会与TYRase结合[6]，同时保护黑素体膜免受氧化应激的损害7, 8。真黑素体还会招募PMEL蛋白，以便在I-II期黑素体（前黑素体）中形成内部条纹，从而实现黑素沉积[9]，在眼皮肤白化病II型（OCA2）中则有助于调节黑素体的pH值4, 10。正如Slominski等人所详细阐述的11, 12，皮肤黑素生成是一个自我调节系统，其中的黑素生成装置可作为自主的稳态传感器，以L-酪氨酸和L-DOPA作为类似激素的信号，独立于它们作为黑素合成底物的功能来调控黑素生成和黑素体形成。这让我们对黑素生成的认知从简单的生化途径转变为一个由代谢、激素和环境信号构成的复杂动态调节系统。
人类皮肤颜色和天然虹膜颜色的差异与SLC24A5基因中的非同义单核苷酸多态性（nsSNP）有关13, 14, 15。该基因在斑马鱼[14]、青蛙[16]、小鼠[17]以及人类的有色组织（黑素细胞/黑素颗粒细胞和视网膜色素上皮）中都有表达14。SLC24A5基因的多态性表现为在第111位将丙氨酸（A）替换为苏氨酸（T），即A111T，这种多态性与欧洲血统人群的较浅肤色有关。A111等位基因在非洲、东亚以及美洲原住民群体中较为常见，而T111等位基因则在浅肤色的欧洲人中几乎普遍存在，且这类人群的皮肤黑素水平较低[18]。在小鼠B16黑色素瘤细胞中敲低Slc24a5基因，以及在正常人类表皮黑素细胞中敲低SLC24A5基因，都会导致黑素合成减少，这说明NCKX5蛋白的活性与黑素生成有关13。NCKX5是一种K?依赖型的Na?/Ca2?交换蛋白[19]，对昆虫High Five细胞中NCKX5蛋白的转运活性进行研究后发现，与野生型A111等位基因相比，T111等位基因的交换活性更低13。综合这些数据可以判断，SLC24A5是决定人类皮肤色素沉着自然差异的主要遗传因素13, 14, 15, 16, 20。
SLC24A5属于K?依赖型的Na?/Ca2?交换蛋白家族SLC24A，该家族包含五个基因成员19, 21。这些基因编码NCKX1至NCKX5蛋白，它们都被认为能够利用钠和钾的电化学梯度将钙离子排出细胞外，且具有相似的结构拓扑。NCKX蛋白共有两组各五个跨膜结构域，这些结构域之间通过一个较大的细胞质环相连。NCKX1 - 4蛋白在细胞膜上发挥作用21, 22，而NCKX5蛋白则不会转运到细胞膜上，而是定位于跨内质网网状结构的细胞内膜上，这一现象在培养的正常人类表皮黑素细胞以及人类MNT1黑色素瘤细胞中都有观察到13, 23。值得注意的是，在非肿瘤性的小鼠黑素细胞（与B16和MEB4黑色素瘤细胞为同源细胞）中，除了跨内质网网状结构外，NCKX5也存在于线粒体中，因此有研究认为它可能在调节黑素体中的Ca2?浓度方面发挥作用（Zhang等人，2019年）。有研究指出，B16和MEB4黑色素瘤细胞既表达NCKX4也表达NCKX5，不过在这些细胞中观察到的K?依赖型Na?/Ca2?交换活性似乎主要是由NCKX4产生的；还有研究在表达NCKX5的HEK293细胞的微粒体中也观察到了这种交换活性[24]。
尽管NCKX5在皮肤色素沉着中起着重要作用，但其离子转运功能与黑素生成之间的关联尚未得到明确证实，而且它定位于跨内质网网状结构而非色素生成细胞器这一特点，也使得人们对其在黑素体形成和/或黑素合成方面的具体功能存在疑问。在这项研究中，我们利用有色人类MNT1黑色素瘤细胞敲低SLC24A5基因，得到了缺乏NCKX5蛋白的脱色dMNT1细胞。我们又引入了三种具有不同转运活性的NCKX5变体，以此研究NCKX5介导的Ca2?转运活性对细胞重新着色的影响。此外，我们还研究了13种已知会影响人类和动物色素沉着的NCKX5变体，以此探讨NCKX5的结构与功能之间的关系。
章节节选
材料与方法
除非另有说明，所有组织培养相关试剂均购自ThermoFisher公司，其他化学试剂则购自Sigma-Aldrich公司。RIPA缓冲液购自Cell Signalling Technology公司（产品编号9806s），蛋白酶抑制剂则由NEB公司提供，产品编号为5871。Bradford检测试剂购自Bio-Rad公司（产品编号500-0006）。酪氨酸酶活性检测试剂盒来自Abcam公司，产品编号为ab252899。涂有聚-D-赖氨酸的35毫米玻璃底培养板则从MatTek公司购买，产品编号为p35gc-1-14-c。
NCKX5基因敲除会导致人类黑色素瘤细胞脱色
为探究NCKX5蛋白在色素沉着中的作用，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，从有色MNT1细胞中构建出了NCKX5基因敲除的稳定细胞系dMNT1。我们假设，如果NCKX5在这些有色人类黑色素瘤细胞的黑素生成和/或黑素体形成过程中起直接作用，那么敲除SLC24A5基因就应该会导致细胞脱色。如方法部分所述，我们使用了三种具有CRISPR/Cas9功能的sgRNA构建体，针对特定外显子进行了编辑
结论
我们认为，本研究呈现的数据共同构成了有力的证据，表明NCKX5的阳离子转运活性对于其在有色细胞中促进真黑素合成而言是不可或缺的。要准确描述细胞内细胞器中的离子转运蛋白和通道仍然是一项技术上的挑战，这使得人们往往难以了解它们的离子特异性和转运动力学，NCKX5也不例外。因此，目前还无法完全明确NCKX5是如何发挥作用的
CRediT作者贡献说明
Tatiana Rogasevskaia：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化处理，研究指导，方法设计，实验开展，正式分析，概念构建。Ali H. Jalloul：实验开展。Robert T. Szerencsei：实验开展。Daniel Major：正式分析。Frank Visser：实验开展。Paul P.M. Schnetkamp：写作——审阅与编辑，研究指导，资金获取，概念构建。
资助情况
这项研究得到了加拿大卫生研究院的运营基金MOP-81327（资助对象为PPMS）的支持。TR感谢蒙特皇家大学提供的编号为#101928的资助。
致谢
作者们感谢卡尔加里大学显微镜实验室的Priyanka Ganguli Mukherjee博士在透射电子显微镜操作培训以及样本固定方面给予的帮助。同时，作者们也要感谢霍奇基斯脑研究所的高级显微镜平台，让他们能够使用共聚焦显微镜。此外，作者们还要感谢Alexei Savchenko博士慷慨地允许他们使用VICTOR Nivo?平板读取仪，同时感谢Shane Ram和Deepak Patel在光谱分析方面提供的帮助。
Tatiana Rogasevskaia|Ali H. Jalloul|Robert T. Szerencsei|Daniel Major|Frank Visser|Paul P.M. Schnetkamp
加拿大阿尔伯塔省卡尔加里市AB T2N 4N1，卡尔加里大学卡明医学院生理学与药理学系
