通过流穿式伪亲和色谱法纯化先进治疗药物：双特异性单克隆抗体、Fc融合蛋白和腺相关病毒

《Biotechnology and Bioengineering》：Purification of Advanced Therapeutics by Flow-Through Pseudo-Affinity Chromatography: Bi-Specific mABs, Fc Fusion Proteins, and Adeno-Associated Viruses

　　

现代生物制药生产需要能够处理结构和功能多样化产品的纯化平台，同时解决去除持久性和高风险宿主细胞蛋白（HCPs）的挑战。当前的纯化过程使用以结合-洗脱模式操作的吸附剂，这限制了生产力，并且常常难以去除关键杂质。为解决这些限制，研究人员开发了一种流穿式伪亲和色谱平台，该平台利用功能化混合模式肽配体（AviGuard）的尺寸排阻树脂（Monomix Core 500）来去除过程相关杂质，同时最大化生产力和产品完整性。本研究评估了该技术在三种治疗模式中的表现：来自中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养液的两个双特异性单克隆抗体（bsAbs）和一个Fc融合蛋白，以及来自HEK293细胞裂解液的腺相关病毒血清型2和9（AAV2和AAV9）。对于CHO来源的蛋白，该平台包括一个使用LigaGuard-Monomix Core 500树脂（LGMC500）的预捕获步骤、一个基于蛋白A的捕获步骤，以及一个使用一次性尺寸排阻混合模式（SEMM）树脂的抛光步骤。该配置实现了超过70%的总体产品收率、最终产品池浓度>15 mg/mL、单体纯度约99%，以及优异的累积HCP清除率（LRV>4.5），残留水平为60–165 ng/mL（4–11 ppm）。对于AAV纯化，该过程使用了一种包含葡聚糖包被活性炭和LGMC500的混合床吸附剂，用于去除HCPs、细胞代谢物和培养基成分，随后使用CaptureSelect AAVX树脂或Natrix CH膜进行捕获步骤。活性炭与树脂体积比（1:3）和负载体积（约10¹⁴ vp/mL树脂）的优化产生了约50%的AAV回收率，残留HCP水平为350 ng/mL，代表每剂量<100 ng，符合监管指南。过程生产力对于CHO来源蛋白为19至23 g/L·hr，对于AAV9约为7×10¹⁴ vp/L·hr，使该技术处于现代生物加工的最佳操作空间。

**论文解读：流穿式伪亲和色谱法在先进治疗药物纯化中的应用**

**研究背景与问题**

过去十年，先进生物治疗药物迅速扩展，包括双特异性单克隆抗体（bsAbs）、Fc融合蛋白和用于基因治疗的病毒载体（如腺相关病毒，AAV）已进入商业和后期临床管线。bsAbs和Fc融合蛋白通过同时结合多个靶点或延长半衰期，提供了超越传统单抗的疗效和选择性。AAV载体（特别是血清型2、5、8、9）成为体内基因递送的主要平台。然而，这些结构多样产品的下游加工仍是一个核心瓶颈。上游强化过程虽能提供每升数克滴度，但也产生更多产品相关杂质（如高分子量/低分子量变体、片段、电荷变体）和过程相关杂质，主要是宿主细胞蛋白（HCPs）和核酸。特别关注的是“高风险”HCPs，如蛋白酶、脂肪酶、氧化还原酶，它们可降解产品或辅料，以及染色质相关物种，它们可引发聚集并具有免疫原性风险。这些杂质常通过传统捕获和抛光步骤而持续存在，导致批次失败、临床暂停和产品召回。随着产品组合转向更复杂的bsAbs、Fc融合蛋白和基因治疗载体，迫切需要结合高生产力与稳健、模式无关的难去除杂质清除能力的纯化平台。对于CHO细胞生产的蛋白，主流下游平台以蛋白A亲和色谱为核心，后接阴离子/阳离子交换或混合模式抛光步骤。但该模板在处理复杂产品时性能下降，bsAbs和Fc融合蛋白常表现出更高水平的聚集和电荷异质性，需要逐案例优化。AAV纯化面临类似但独特的挑战，如蛋白基亲和配体易受宿主蛋白酶降解，AAV衣壳本身也易受损。为此，研究人员开发了基于LigaGuard-Monomix Core 500树脂（LGMC500）的流穿式伪亲和色谱平台，旨在作为模式无关的杂质清除器，应用于多种先进治疗药物。该研究发表在《Biotechnology and Bioengineering》。

**研究概述与结论**

研究人员将LGMC500树脂应用于三种治疗模式：CHO来源的bsAbs和Fc融合蛋白，以及HEK293来源的AAV2和AAV9。对于CHO蛋白，构建了三步平台：LGMC500流穿式预捕获杂质清除、蛋白A捕获、SEMM硅胶树脂流穿式抛光。对于AAV，采用葡聚糖包被活性炭（DCC）与LGMC500混合床进行预处理，后接亲和捕获（CaptureSelect AAVX树脂或Natrix CH膜）。结果表明，该平台在CHO蛋白中实现了>70%的总体收率、>99%的单体纯度、HCP清除率LRV>4.5，残留HCP 60–165 ng/mL。对于AAV9，优化DCC:树脂比1:3，获得约50%收率，残留HCP 350 ng/mL（<100 ng/剂量）。过程生产力CHO蛋白为19–23 g/L·hr，AAV9为7×10¹⁴ vp/L·hr。该研究证实LGMC500作为高生产力杂质清除器的平台潜力，适用于生化结构多样的治疗药物。

**主要关键技术方法**

1. **流穿式伪亲和色谱树脂（LGMC500）**：采用核壳结构，亲水尺寸排阻壳层排除治疗产品（>400–700 kDa），功能化核心通过混合模式肽配体（AviGuard）以静电、疏水和氢键多价相互作用捕获HCPs、DNA和代谢物。
2. **混合床吸附剂（DCC/LGMC500）**：针对HEK293细胞裂解液，将葡聚糖包被活性炭（DCC）与LGMC500按体积比1:3混合，DCC去除小分子代谢物、脂质和核苷酸，LGMC500去除HCPs，两者协同作用。
3. **定量蛋白质组学分析**：采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合数据非依赖采集（DIA）模式，对CHO细胞培养液和纯化流分进行蛋白质组鉴定和定量，追踪高风险HCPs的清除。
4. **分析尺寸排阻色谱（SEC-HPLC）**：用于监测单体/衣壳纯度、高分子量聚集体和低分子量片段。
5. **ELISA和qPCR**：分别定量HCP和宿主细胞DNA（hcDNA）水平。
样本来源：CHO细胞培养液（bsAbs和Fc融合蛋白）由工业合作者提供；HEK293细胞裂解液（AAV2和AAV9）来自北卡罗来纳州立大学NC-VVIRAL。

**研究结果**

**3.1 从CHO细胞培养液中纯化双特异性抗体和Fc融合蛋白**
通过LGMC500预捕获、蛋白A捕获和SEMM抛光的三个步骤，研究人员对bsAb1、bsAb2和Fc融合蛋白进行了纯化。LGMC500在负载比15 g HCP/mL树脂时，实现了约91%的步骤收率，将HCP降低约30倍，hcDNA降低约10倍，并显著减少高分子量聚集体（从5.5%降至0.8%）。蛋白A捕获进一步浓缩产品并降低HCP至7–26 ppm，SEMM抛光将单体纯度提升至>99%，最终HCP和hcDNA降至2 ppm和4 ppb（bsAb1）及3 ppm和8 ppb（bsAb2）。Fc融合蛋白因pI较低，需调整pH至6.5，LGMC500后HCP降至4222 ppm，综合收率约60%，最终纯度仍满足要求。总体收率bsAb1和bsAb2分别为75%和76%，Fc融合蛋白约60%，HCP LRV分别为5.5、5.7和4.6。

**3.2 蛋白质组学分析：记录高风险和持久性HCPs的去除**
通过LC-MS/MS分析，研究人员追踪了三种产品纯化过程中HCP种类的变化。起始CHO收获液含2580种HCP（bsAb1），经LGMC500后降至648种，蛋白A后降至89种，SEMM后降至约30种，累计清除率98.8%。bsAb2和Fc融合蛋白类似，最终分别剩27和47种HCP。高风险HCPs（如组织蛋白酶、脂蛋白脂肪酶、磷脂酶B样2、组蛋白、伴侣蛋白、过氧化物氧化还原酶等）被有效清除。例如，组织蛋白酶B、D、L、Z在LGMC500流出液中降至检测限以下；脂蛋白脂肪酶在蛋白A洗脱液中几乎消失；组蛋白H2B和H4被LGMC500捕获约40倍减少。残留HCP主要为低风险管家蛋白（如GAPDH、肌动蛋白、微管蛋白），浓度极低，符合监管要求。

**3.3 用于AAV9流穿式纯化的树脂选择与表征**
研究人员比较了LGMC500、Monomix Core 500（MC500）和Capto Core 400（CC400）三种核壳树脂，并与DCC按不同体积比混合。对于AAV9，纯树脂（0:1 DCC）收率87%–94%，HCP LRV约0.4–0.55。加入DCC后收率下降，但HCP清除率在1:3 DCC:树脂比时达到峰值（LGMC500 LRV 0.92，收率80%）。SEC-HPLC分析显示，LGMC500/DCC有效去除AAV片段和HCPs，且小分子杂质被完全消除。DCC去除小分子代谢物，减轻了对LGMC500核心结合位点的竞争。1:3比例被选为最优配置。

**3.4 AAV9纯化：收率与纯度对LGMC500/DCC比例的依赖**
通过系统评估5种DCC:树脂比，研究人员发现LGMC500在各比例下HCP清除均优于MC500和CC400，尤其在1:3时达到最优。累积收率与HCP LRV呈非单调关系，峰值在1:3。重复使用5个循环后，性能稳定（收率83%–87%，HCP LRV 0.8–0.9），表明LGMC500/DCC混合床吸附剂可重复使用。

**3.5 经LGMC500/DCC预处理后AAV2和AAV9的捕获：亲和与混合模式吸附剂的性能**
将CaptureSelect AAVX树脂直接加载澄清裂解液时，AAV9步骤收率从第1次循环的63%降至第10次循环的28%，HCP LRV稳定在3.2–3.7。而经LGMC500/DCC预处理后，收率稳定在59%±4%，HCP LRV 3.8±0.4，表明预处理保护了蛋白配体免受蛋白酶降解和表面污染。对于Natrix CH膜，直接加载裂解液时AAV2和AAV9收率分别为73%和88%，HCP LRV仅1.25和0.3；预处理后收率升至87%和92%，HCP LRV升至1.85和1.70，表明预处理减少了非特异性吸附和共洗脱。SEC-HPLC显示所有条件下衣壳完整性均保持。

**总结讨论与结论**

本研究表明，LigaGuard功能化核壳树脂LGMC500作为一种变革性的伪亲和色谱模块，可选择性地去除难处理的、高风险杂质，同时保持产品完整性和高通量处理能力。通过将杂质清除从结合-洗脱抛光步骤转变为模块化流穿操作，该方法解耦了杂质去除与产品捕获，降低了过程对模式特异性抛光开发的敏感性。对于CHO蛋白，三步平台生产力达19–23 g/L·hr，优于传统抛光步骤的10–15 g/L·hr。对于AAV9，DCC/LGMC500预处理结合免疫亲和捕获，生产力达7×10¹⁴ vp/L·hr。LGMC500平台能够处理从CHO来源抗体和Fc融合蛋白到HEK293来源病毒载体的广泛产品类型和杂质谱。未来工作应聚焦于将LigaGuard识别元件转移到对流基底（如膜和整体柱）上，以实现更低停留时间，并考虑放大和GMP实施，包括树脂寿命、清洁策略、集成到连续生产流程，以及数据驱动的控制策略。总体而言，该研究支持了流穿式和伪亲和技术的创新前景，扩展了下游工具包，使复杂生物制品的生产更高效可靠，改善患者获得救命疗法的机会。

**研究结论部分翻译**
本研究将LigaGuard功能化核壳树脂LGMC500引入作为先进治疗药物纯化的变革性伪亲和色谱模块。该吸附剂选择性去除难处理的高风险杂质，同时保持产品完整性并实现高通量处理。通过将杂质清除从结合-洗脱抛光步骤转变为模块化流穿操作，这种方法解耦了杂质去除与产品捕获，降低了对模式特异性抛光开发的敏感性。该架构带来的生产力提升显著：所提出的三步CHO平台生产力为19–23 g/L·hr，优于当前过程（抛光步骤通常约10–15 g/L·hr）以及近期研究中的伪连续过程。对于AAV9流程，DCC/LGMC500预处理步骤与免疫亲和捕获配对，过程生产力达7×10¹⁴ vp/L·hr。LigaGuard平台的一个关键进展是能够处理从CHO来源抗体和Fc融合蛋白到HEK293来源病毒载体的广泛产品身份和杂质谱。伪亲和肽配体识别结合核壳珠形态，能够靶向通常在传统平台中持续存在且仅以牺牲收率为代价才去除的杂质类别，同时维持高生产力。将LGMC500与捕获步骤或其他适合目的的下游操作配对，提供了工业上相关的路径，以增强对进料变异性的稳健性，并改善对昂贵亲和吸附剂的保护和利用。未来工作应专注于将LigaGuard生物识别元件转移到对流基底（如膜和整体柱）上，以在低停留时间（<30秒）下操作并进一步提高生产力。同样重要的是放大和GMP考虑因素，包括树脂寿命和清洁策略、集成到完全连续生产流程，以及由正交分析支持的数据驱动控制策略。本研究为创新流穿式和伪亲和技术扩大了下游工具包，使复杂生物制品的生产更高效可靠，改善患者获得救命疗法的机会。