负载氟芬那酸的靶向HER-2脂质体：一种计算与体外联合研究方法

《Journal of Molecular Structure》：Flufenamic Acid-Loaded Liposomes Targeting HER-2: A Combined Computational and In Vitro Investigation

　　•氟芬那酸被重新用作一种具有潜力的HER2抑制剂。•通过1000纳秒的分子动力学模拟验证了其与HER2的稳定结合。•脂质体配方提升了药物的稳定性及包裹效率。•与游离药物相比，其在MCF-7细胞中的细胞毒性更强。•能诱导ROS介导的细胞凋亡以及G0/G1细胞周期阻滞。

引言
乳腺癌是迄今为止所有地区最为常见的癌症类型，无论其发展水平如何。流行病学证据表明，乳腺癌是一种受遗传和非遗传风险因素影响的多种因素共同作用的疾病。激素致癌作用已被证实，早期初潮、晚期绝经、未生育、首次生育年龄较大以及哺乳时间较短等因素都会增加雌激素暴露，进而导致乳腺上皮细胞发生恶性转变[1]。与生活方式相关的因素，如酒精摄入、肥胖（多见于绝经后妇女）以及缺乏运动，会通过改变雌激素代谢和引发慢性低度炎症进一步增加患病风险[2]。尽管BRCA1和BRCA2等高外显率基因的遗传突变会显著提高个体患病风险，但这些基因变化只能解释极少数乳腺癌病例。这一事实凸显出那些在人群层面起作用的主要非遗传性、可调节的风险因素[3]。

乳腺癌是一组具有不同分子特征、临床表现和治疗反应的异质性疾病。分子生物学的进步使得可以根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）以及人类表皮生长因子受体2（HER-2）的状态将乳腺癌分为不同亚型，这对于预后判断和治疗方案选择至关重要[4,5]。激素受体阳性、HER-2阴性的肿瘤约占所有病例的三分之二，这类肿瘤通常临床进展较缓，以内分泌治疗作为系统性治疗的基石。相比之下，最初预后较差的HER-2阳性肿瘤在经过针对HER2的治疗后，其治疗效果有了显著改善，而三阴性乳腺癌则仍是一种侵袭性较强的亚型，目前可用的靶向治疗手段有限，且存在较高的早期复发和转移风险[6,7]。尽管在HER2靶向治疗方面取得了重大进展，包括使用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗等单克隆抗体，以及奈拉替尼、吡罗替尼和拉帕替尼等酪氨酸激酶抑制剂，但治疗耐药性和不良反应仍然是主要的临床挑战。尤其是HER2突变，包括20号外显子插入突变，会导致对传统疗法的敏感性降低，这就需要开发替代性的治疗策略。

对于早期癌症，手术仍是治疗的基石，可采用保乳手术或乳房切除术，之后往往还会进行放疗以降低局部复发的风险[8]。辅助治疗旨在预防微转移状态下的疾病复发，或者术前进行系统性治疗以缩小肿瘤体积，从而更好地保护器官功能，并评估体内的治疗反应[9]。系统性治疗的选择已经大大扩展，包括内分泌治疗、细胞毒性化疗、靶向生物制剂以及免疫疗法[10]。内分泌治疗，包括选择性雌激素受体调节剂、芳香化酶抑制剂以及卵巢抑制策略，在激素受体阳性疾病中疗效显著，能够有效降低复发率和死亡率。化疗仍然是高风险早期疾病辅助治疗的支柱，同时也用于大多数三阴性乳腺癌患者的治疗。靶向治疗，主要是针对HER-2的药物治疗，已显著改善了HER-2阳性乳腺癌的预后，而PARP抑制剂则为携带种系BRCA突变的患者带来益处。近期，免疫检查点抑制剂在某些乳腺癌亚型中也显示出疗效，包括晚期三阴性乳腺癌[11]。尽管在治疗方面取得了进展，但转移性乳腺癌几乎仍然无法治愈，治疗主要以姑息性为主，不同分子亚型的生存期差异很大，其中激素受体阳性和HER-2阳性转移性乳腺癌的生存期相对更长，优于三阴性乳腺癌[12]。

鉴于这些局限，在乳腺癌领域重新利用现有药物的重要性日益凸显[13]。这种相对较新的方法可以缩短药物研发的时间并降低成本，尤其是对于那些已经过FDA批准、且因曾经过安全性/毒理学研究而能更快通过临床试验的天然产物和合成药物而言[14]。药物重新利用既包括计算方法，也包括非计算方法。实际上，生物信息学、基因组学和系统生物学与计算方法类似，都能在药物重新利用中发挥关键作用。氟芬那酸是一种含有活性单羧酸基团的非甾体抗炎药。除了抗炎作用外，氟芬那酸还被认为具有潜在的抗癌作用。然而，该药物几乎不溶于水，导致吸收效果不佳，而且口服后会引发严重的胃肠道副作用[15]。这些局限性凸显出需要有效的递送策略来提升其治疗潜力。

为了解决这些难题，基于纳米技术的药物重新利用作为一种极具前景的癌症治疗策略应运而生，尤其是在乳腺癌治疗领域，它能够克服传统化疗存在的诸多局限[16,17]。各种先进的纳米载体，包括聚合物纳米材料、尼奥斯体、双囊体、脂质体、固体脂质纳米颗粒以及树状大分子，都具有更好的药代动力学特性和生物分布特性，既能提高对肿瘤的靶向性，又能降低全身毒性[18], [19], [20], [21], [22], [23]。其中，脂质体是最为成熟的纳米载体，也是经过临床验证的药物递送系统，它能够携带亲水性和疏水性药物，同时还具备生物相容性好、表面可功能化以及循环时间较长等优点，非常适合用于针对乳腺癌的精准治疗[24]。本研究旨在探讨氟芬那酸作为针对HER2的重新利用治疗策略的潜力，通过基于结构的靶点分析结合脂质体递送技术，以提高其生物利用度和治疗效果，同时解决直接使用游离氟芬那酸所带来的问题。通过一系列详细的细胞毒性实验和机制研究，阐明了氟芬那酸脂质体复合物的抗癌功效及其在调控HER-2介导的信号通路中的作用。

片段内容
虚拟筛选：采用基于分子对接的虚拟筛选方法，借助AutoDock Vina 1.2版本的蒙特卡洛算法，评估了FDA批准的药物与野生型及突变型HER2的结合亲和力及相互作用模式。蛋白质结构来自蛋白质数据银行：野生型HER2（PDB: 7PCD）和20号外显子插入突变型（PDB: 8U8X）。这些结构先通过CHARMM-GUI软件进行预处理，包括去除配体/水分子、添加氢原子等操作。

分子对接分析：利用非突变型HER2（PDB ID: 7PCD）和带有20号外显子插入突变的HER2（PDB ID: 8U8X）作为模型，对FDA批准的药物进行了计算机模拟研究，比较它们与共晶结构以及拉帕替尼的结合亲和力及相互作用模式（见图1）。在野生型HER2的共晶结构中，拉帕替尼的结合能最低为-8.5千卡/摩尔，其次是西洛多辛（-9.8千卡/摩尔）、氟芬那酸（-8.2千卡/摩尔）和黄芦丁（-9.6千卡/摩尔），其他药物的结合能相对更低。

结论
本研究提出了一种系统的药物重新利用策略，整合了基于结构的计算分析、脂质体配方设计以及体外评估方法，旨在探索氟芬那酸在乳腺癌治疗中的潜在应用价值。长时程分子动力学模拟证实，氟芬那酸能与HER2激酶域形成稳定的、对突变敏感的结合，这表明它有潜力被用作重新开发的HER2抑制剂。将氟芬那酸封装在脂质体中，有望进一步提升其治疗效果。

CRediT作者贡献说明
PKS、KC和PP：概念构思、数据整理、定量分析、方法设计、研究设计、初稿撰写以及论文修订。TA、AMA、YIA、SM和HMA博士：数据整理、定量分析、方法研究以及结果可视化。PP：资金筹集、实验开展、结果可视化、方法设计、定量分析、初稿撰写、论文撰写以及校对工作。所有作者均阅读并认可了最终稿件。

资金支持：无。

数据提供：数据将在有需求时提供。

出版许可：无需特殊许可。

利益冲突：作者声明没有可能影响本文研究结果的任何已知利益冲突或个人关系。

CRediT作者贡献说明
塔哈·阿尔卡塔尼：论文修订、验证、方法研究、实验开展、定量分析、数据整理以及概念构思。阿里·M·阿尔卡塔尼：论文修订、软件应用、定量分析以及数据整理。叶海亚·I·阿西里：论文修订、验证、定量分析以及数据整理。哈南·M·阿尔哈比：论文修订、验证、方法研究、定量分析以及数据整理。库马兰潘·奇丹巴拉姆：论文修订、验证、资源准备、方法研究。

利益冲突声明：作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢：作者感谢卡利德国王大学科学研究院通过编号为RGP2/413/46的大型团队研究项目为这项研究提供的资金支持。

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