《Diagnostic Cytopathology》：Utility of Fine Needle Aspiration Supernatant for Real-Time PCR–Based Mutation Analysis in Non–Small Cell Lung Cancer
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背景：个性化治疗和分子测序的出现显著改变了晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的管理。细针穿刺（FNA）获得的上清液已被证明是分子检测中高质量核酸的可靠来源。可能影响分子分析成功的一个分析前因素是用于FNA冲洗的收集介质。方法：这项前瞻性研究评估了在三种不同介质中收
背景：个性化治疗和分子测序的出现显著改变了晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的管理。细针穿刺（FNA）获得的上清液已被证明是分子检测中高质量核酸的可靠来源。可能影响分子分析成功的一个分析前因素是用于FNA冲洗的收集介质。方法：这项前瞻性研究评估了在三种不同介质中收集的31份FNA标本——CytoRich Red、10%中性缓冲福尔马林或10%牛血清白蛋白（BSA）——以评估它们对DNA产量以及KRAS（Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物）和/或EGFR（表皮生长因子受体）突变实时聚合酶链反应（RT-PCR）结果的影响。使用QIAamp DNA FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）组织试剂盒（Qiagen）进行DNA提取，并使用QIAGEN therascreen EGFR或KRAS RGQ PCR试剂盒进行RT-PCR。同时进行的直接涂片或来自细胞块或芯针活检的福尔马林固定石蜡包埋组织作为标准对照。结果：在CytoRich Red组中，分析了11份标本（9份腺癌和2份NSCLC）。所有11份标本均产生与标准对照一致的结果。一份标本因初始预测试质量控制失败而需要重复DNA提取。福尔马林组包括12份标本（7份鳞状细胞癌[SCC]、3份腺癌、1份NSCLC和1份大细胞神经内分泌癌）。9份标本与对照产生一致结果。两份标本的EGFR突变呈阴性，尽管相应的对照组织未进行检测。6份由于初始预测试失败而需要重复DNA提取，一份标本在重新提取后仍无效。在BSA中收集了8份标本（5份腺癌、2份NSCLC和1份SCC）。5份与标准对照产生一致结果，而3份标本尽管重复DNA提取，仍未能通过PCR预测试。结论：在这个小型队列中，CytoRich Red在基于RT-PCR的突变检测中表现出可靠的性能。FNA上清液代表了肺癌分子分析的一种实用替代标本，可能优化标本利用，同时保留细胞块材料。
在个性化医疗时代，晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的分子分析已成为指导靶向治疗的关键环节。随着美国国家综合癌症网络（NCCN）指南不断扩展推荐检测的生物标志物清单（包括EGFR、KRAS、ALK、ROS1、BRAF、MET、RET、ERBB2、NTRK及PD-L1免疫组化等），病理学家面临有限组织样本在多重检测间的优先分配难题。内镜超声引导下细针穿刺（EBUS-FNA）因其微创且兼具诊断与分期功能，已成为疑似肺癌患者的标准评估手段。然而，传统甲醛固定石蜡包埋（FFPE）细胞块（CB）在分子检测中常需消耗大量标本，且处理流程耗时较长。近年来，FNA针道冲洗液的上清液被证实可获取高质量核酸，用于检测可靶向突变及基因融合，且能缩短分子检测周转时间，同时保留细胞块材料用于形态学评估和免疫组化。但分析前因素——尤其是收集介质——可能影响核酸质量和分子检测成功率。本研究旨在评估三种常用收集介质（CytoRich Red、10%中性缓冲福尔马林、10%牛血清白蛋白[BSA]）对FNA上清液DNA产量及实时PCR（RT-PCR）突变检测性能的影响，以优化临床工作流程。
研究人员在印第安纳大学病理学与检验医学系开展了一项前瞻性研究，于2024年8月至2025年4月期间，收集了31份经快速现场评估（ROSE）诊断为NSCLC的FNA标本。所有标本均来自肺、纵隔淋巴结或胸壁病灶。每个病例指定一个针道专门用于研究，分别收集于5 mL的CytoRich Red（11例）、10%中性缓冲福尔马林（12例）或10%BSA（8例）中。研究主要关键技术方法包括：对FNA上清液进行离心（3000 rpm，5 min）以去除细胞碎片，取上清进一步浓缩后使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒（Qiagen）提取DNA；采用NanoDrop分光光度计测量DNA浓度；使用QIAGEN therascreen EGFR或KRAS RGQ PCR试剂盒（基于扩增受阻突变系统[ARMS]和蝎形探针实时PCR）检测KRAS及EGFR热点突变；同时以直接涂片、FFPE CB或芯针活检作为标准对照，进行相同DNA提取和突变检测。所有标本在预测试步骤（评估可扩增DNA总量的质量控制）后进入突变特异性PCR。
研究结果按不同收集介质分组呈现如下：
**CytoRich Red组**：11份标本（6例肺、4例纵隔淋巴结、1例胸壁；9例腺癌、2例NSCLC）中，DNA产量范围为132–3804 ng，上清液在?20°C储存最长94天。10份检测KRAS突变，1份同时检测KRAS和EGFR。共检出5例KRAS突变（2例p.G12C、2例p.G12V、1例p.G13D），1例EGFR阴性。所有11份标本的突变结果与标准对照完全一致（100%一致率）。仅1份标本因初始预测试质量控制失败而需重复DNA提取，但第二次提取后成功。
**福尔马林组**：12份标本（10例肺、2例纵隔淋巴结；7例鳞状细胞癌[SCC]、3例腺癌、1例NSCLC、1例大细胞神经内分泌癌）中，DNA产量范围为72–1248 ng，储存时间最长136天。7例SCC检测EGFR，其余5例检测KRAS。11份标本获得有效结果，包括3例KRAS突变（2例p.G12A、1例p.G12C）和8例阴性（2例KRAS阴性、6例EGFR阴性）。9份与标准对照一致，另2份SCC的对照未进行分子检测。6份标本（2例腺癌、4例SCC）因初始预测试失败需重复DNA提取，其中1份SCC在重复提取后仍无效。
**BSA组**：8份标本（5例纵隔淋巴结、3例肺；5例腺癌、2例NSCLC、1例SCC）中，DNA产量范围为120–420 ng，储存时间最长120天。6例检测KRAS，1例检测EGFR，1例同时检测两者。5份标本获得有效结果（均为阴性），与标准对照完全一致。其余3份标本（B6、B7、B8）虽重复DNA提取，仍未能通过PCR预测试，结果无效，但对应的标准对照均为阴性。
讨论部分指出，三种介质中只要通过预测试的标本均与标准对照100%一致，但福尔马林组和BSA组预测试失败率较高（分别为6/12和3/8）。失败标本多来自卫星医院，需室温运输至主实验室，可能导致核酸降解。BSA虽能结合PCR抑制剂并改善酶性能，但不适合长期保存，尤其当标本需延迟处理或转运时。福尔马林因引起核酸与蛋白质交联，导致DNA片段化和聚合酶可及性降低，而基于乙醇的非交联固定液（如CytoRich Red）通常产生更高品质DNA。CytoRich Red虽含少量甲醛，但本研究中证明其可靠：储存94天后仍能获得足够DNA，且所有标本结果一致。研究还讨论了FNA上清液的应用优势：可缩短周转时间（Gokozan等报告NGS周转时间减少约30%，每样本节省50美元），并降低处理成本，因省去了FFPE处理步骤（如石蜡块检索、切片、脱蜡等）。此外，关于如何整合上清液分子检测与免疫组化（如PD-L1评估）的问题，研究指出酒精基固定液可能影响PD-L1染色强度，CytoRich Red在对比中与福尔马林固定细胞块的一致性优于其他酒精基固定液，但所有酒精基固定液均导致PD-L1信号减弱，存在低估表达的风险。研究局限性包括：前瞻性设计未选特定肿瘤类型，福尔马林组中SCC比例偏高导致组间分布不均；样本量较小，每组仅检测一或两个基因，难以得出确凿结论；未来计划转向22基因NGS panel，并计划对FNA上清液进行NGS验证。
结论部分翻译如下：尽管收集介质和处理方案存在差异，EBUS-FNA上清液始终能产生高质量核酸，并与参考标准分子结果高度一致。将上清液纳入常规工作流程可能改善标本利用，尤其对于小样本或有限标本。研究结果还表明，CytoRich Red是适用于下游基于RT-PCR突变分析的合适收集介质。
