《Biomedical Chromatography》：Validation of an UHPLC–MS/MS Assay for the Quantification of Isoniazid and Four Major Metabolites in Human Plasma
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异烟肼（INH）是结核病治疗方案的关键组成部分，但也与肝毒性相关。这种毒性部分由其代谢物介导，但某些代谢物在血浆中迅速降解。研究人员开发了一种快速冻融过程结合甲醇蛋白沉淀提取法，以减缓乙酰异烟肼（AcINH）在血浆中迅速降解为异烟酸（INA）和乙酰肼（AcHZ
异烟肼（INH）是结核病治疗方案的关键组成部分，但也与肝毒性相关。这种毒性部分由其代谢物介导，但某些代谢物在血浆中迅速降解。研究人员开发了一种快速冻融过程结合甲醇蛋白沉淀提取法，以减缓乙酰异烟肼（AcINH）在血浆中迅速降解为异烟酸（INA）和乙酰肼（AcHZ）的过程。研究人员开发并验证了一种包含两种UHPLC-MS/MS方法的分析流程，用于测定人血浆中INH及其四种代谢物的浓度：“极性”方法涵盖AcINH和INA，“非极性”方法涵盖对甲苯甲醛衍生的AcHZ、肼（HZ）和INH。极性和非极性方法的色谱分离分别使用联苯或C18色谱柱、4 mM甲酸铵水溶液或乙腈作为流动相，以及方法特定的梯度条件。AcINH、INA和INH的验证范围为10.0至5000 ng/mL，AcHZ和HZ的验证范围为10.0至500 ng/mL，均使用0.1 mL血浆。尽管其他研究小组已验证了定量部分或全部这些分析物的方法，但尚未有充分表征或解决AcINH降解问题的方法。该验证方法将有助于更好地理解INH代谢物处置及其与毒性的关系。
异烟肼（INH）是结核病治疗的关键药物，但常伴随药物性肝损伤（DILI），其机制部分归因于反应性代谢物的形成与免疫介导反应。INH的代谢途径复杂，涉及乙酰异烟肼（AcINH）、异烟酸（INA）、乙酰肼（AcHZ）和肼（HZ）等多种代谢物，其中AcHZ和HZ可进一步转化为活性氧，导致肝毒性。然而，AcINH在血浆中迅速降解为INA和AcHZ，而现有液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法未能充分表征或抑制这一降解过程，导致对低浓度代谢物的定量偏差。为准确理解INH代谢物暴露-反应关系，研究人员开发并验证了一种快速冻融技术结合甲醇蛋白沉淀的UHPLC-MS/MS方法，在《Biomedical Chromatography》上发表。该研究旨在解决AcINH不稳定性问题，并建立同时定量INH、AcINH、INA、AcHZ和HZ的可靠方法。
**技术方法概述**：研究采用Thermo Scientific TSQ Altis Plus质谱仪，极性方法使用Accucore Biphenyl色谱柱（2.1×100 mm，2.6 μm）分离AcINH和INA，非极性方法使用Acquity UPLC HSS T3色谱柱（2.1×100 mm，1.8 μm）分离INH、AcHZ和HZ（后者经对甲苯甲醛衍生化）。样品前处理包括甲醇蛋白沉淀，并采用快速冻融流程（50°C加热块快速解冻，干冰快速冷冻）以抑制AcINH降解。人血浆样本来源包括BioIVT的商业化K2 EDTA血浆，以及两项临床研究：一项内部IRB批准的研究（COMIRB #09-0761）和一项大型随机对照试验（IMPAACT，NCT01494038）中孕产妇HIV患者的二次研究样本。
**研究结果**：
- **3.1 方法开发**：通过优化色谱柱和流动相（4 mM甲酸铵替代甲酸）实现AcHZ和INH的基线分离，消除源内碎裂导致的交叉干扰；采用甲醇蛋白沉淀优于乙腈，避免分析物抑制；开发快速冻融法，将AcINH降解控制在最低水平；衍生化后样品需在自动进样器内放置至少6小时以实现完全衍生化；AcINH标准品中微量的INH杂质不影响定量。
- **3.2 方法验证**：选择性验证显示六份不同来源血浆无显著干扰；溶血血浆对HZ的定量下限（LLOQ）水平产生显著基质效应（5%溶血时偏差36.3%），但在2.5%及以下水平可接受；特异性检验中，临床常用合并用药（如拉米夫定、替诺福韦等）无干扰；交叉串扰仅HZ与其内标之间存在可接受信号（8.7%）。校准曲线范围：AcINH、INA、INH为10.0–5000 ng/mL，AcHZ、HZ为10.0–500 ng/mL，各分析物采用二次或线性拟合，加权因子优化后，批间准确度在±5.9%以内，精密度≤13.5%。准确度和精密度：批间准确度偏差在±5.4%以内，批内准确度偏差在±7.4%以内，批间精密度≤5.6%，批内精密度≤6.1%。稀释完整性验证表明5倍稀释适用于所有分析物，10倍稀释适用于AcHZ和HZ。基质效应分析显示内标校正后峰面积比基质效应在99.2%–113%之间，回收率96.7%–106%，过程效率95.8%–120%。台架稳定性：QC样品室温30分钟稳定，AcINH单独样本在室温下30分钟内INA和AcHZ峰面积比分别增加2431%和5410%，证实快速处理必要性。冻融稳定性：三次快速冻融循环后，所有分析物偏差在±7.2%以内（与对照相比）。再注射重现性：极性方法放置3天、非极性方法放置4天后再注射，结果偏差在±4.9%以内。长期稳定性：内标储备液（PS1）稳定371–557天，加标QC溶液稳定70天，血浆校准品稳定119天，血浆QC稳定168天。
- **3.3 临床样本应用**：全血稳定性试验表明，若血液样本置于室温，INA和AcHZ浓度随时间显著升高（4小时分别升高48.0%和25.1%），而冰上保存可维持稳定；样本再分析（ISR）测试中，14份样本的重复分析结果偏差在±9.4%以内，验证了快速冻融过程的重现性。
**总结讨论**：本方法通过快速冻融技术有效限制了AcINH降解为INA和AcHZ，这是现有方法未能实现的创新。研究结论指出，该UHPLC-MS/MS方法能够准确、精确定量人血浆中INH及其四种代谢物，验证范围覆盖临床相关浓度。然而，溶血样本中HZ的定量需谨慎，高溶血水平（5%）会显著偏高；AcHZ的定量上限（500 ng/mL）可能不足以覆盖部分临床样本，而HZ的LLOQ（10 ng/mL）可能偏高，导致许多样本低于定量限。未来需要扩展定量范围并积累长期基质稳定性数据。该方法已成功应用于非妊娠及妊娠HIV女性的INH预防性治疗药代动力学研究，有助于阐明INH代谢物处置与肝毒性之间的关系，为优化患者治疗提供依据。
