综述：半胱氨酸肽酶在抗肿瘤免疫中的作用：抗原呈递细胞调控与治疗潜力的解析

《iMetaMed》：Cysteine Peptidases in Antitumor Immunity: Unraveling Antigen-Presenting Cell Regulation and Therapeutic Potential

　　

本综述系统总结了半胱氨酸肽酶在调节抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cell，APC）功能和抗肿瘤免疫反应中的核心作用，强调了其在克服肿瘤免疫逃避方面的关键意义。当前研究已证实，半胱氨酸肽酶亚型，包括组织蛋白酶B（Cathepsin B，CTSB）、组织蛋白酶S（Cathepsin S，CTSS）、组织蛋白酶L（Cathepsin L，CTSL）和组织蛋白酶X（Cathepsin X，CTSX），在树突状细胞和肿瘤相关巨噬细胞的抗原加工、主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）分子负载、交叉呈递及免疫调节信号通路中发挥多方面效应。这些酶的失调导致抗原呈递受损、T细胞功能障碍以及免疫抑制性肿瘤微环境形成，构成有效免疫治疗的主要障碍。尽管在阐明其分子机制方面取得显著进展，但在理解细胞类型特异性、时空动态性及环境依赖性功能方面仍存在空白。本综述整合了肽酶靶向策略的最新进展，包括小分子调节剂、纳米载体以及与免疫检查点抑制剂的联合疗法，为将基础研究转化为临床应用提供了全面框架，并应对了对新型免疫治疗靶点的迫切需求。

1 引言

1.1 抗原呈递细胞（APC）与抗肿瘤免疫的核心联系

抗原呈递细胞（APC），特别是树突状细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAM），是启动CD8⁺ T细胞介导的抗肿瘤反应的关键枢纽。APC捕获、加工和呈递肿瘤抗原的能力高度依赖于溶酶体半胱氨酸肽酶的活性。在免疫抑制性肿瘤微环境（TME）中，APC常发生功能性损伤或耐受，构成肿瘤免疫逃避的核心机制之一。研究表明，肿瘤相关巨噬细胞溶酶体中半胱氨酸蛋白酶活性异常上调是导致其抗原呈递缺陷的关键因素，该活性加速吞噬的肿瘤抗原过度和非特异性降解，破坏关键的免疫原性表位，使其无法与MHC分子结合，最终阻碍向T细胞传递有效的“第一信号”。半胱氨酸蛋白酶介导的肿瘤免疫逃避两大核心通路包括：（1）肿瘤抗原过度降解通路：CTSL和CTSK等酶在M2极化TAM中富集，过度降解肿瘤抗原，导致免疫原性肽丢失，伴随TGF-β、IL-4和IL-13进一步调节TAM功能，引发T细胞功能耗竭；（2）通过PD-L1调控直接抑制T细胞：CTSS调节肿瘤细胞和TAM上的PD-L1表达，而PD-1/PD-L1相互作用直接抑制T细胞活性，同时TAM从M1向M2表型极化，分泌IL-10强化免疫抑制。此外，CTSS还通过调节MHC II类抗原呈递途径影响CD4⁺ T细胞活化。半胱氨酸肽酶在抗原呈递细胞介导的免疫激活与肿瘤进展中具有双重作用，其功能受翻译后修饰、亚细胞定位及TME因素（如缺氧和TGF-β）影响。

1.2 半胱氨酸肽酶研究现状与突破需求

尽管在阐明半胱氨酸肽酶功能方面取得进展，但其在不同细胞亚群和病理阶段的精确调控机制及时空特异性仍待解决。在交叉呈递过程中，CTSB的定位和活性至关重要，下调其活性可减少早期内体/吞噬体中的抗原降解，增强细胞膜上MHC-I分子的聚集和稳定性，提高CD8⁺ T细胞活化效率。临床前模型显示，CTSB抑制与PD-1抗体联用可显著增加T细胞肿瘤浸润深度和细胞毒性，产生协同抗肿瘤效应。在先天免疫调节中，半胱氨酸组织蛋白酶作为细胞内传感器和效应分子，通过精细调节Toll样受体（TLR）信号通路和细胞因子分泌参与免疫细胞活化。然而，该酶家族失调是免疫逃避和肿瘤进展的重要驱动因素，其作用具有高度环境依赖性。跨癌种比较显示，不同癌症中半胱氨酸肽酶的表达和功能模式各异：结直肠癌中CTSS在TAM中持续上调并与PD-L1表达正相关；黑色素瘤中ti-DC3s的CTSL和CTSB活性升高与Treg诱导相关；胰腺导管腺癌中CTSB和CTSL在癌相关成纤维细胞中过表达促进ECM降解和转移；三阴性乳腺癌中高CTSL表达与不良预后和侵袭增强相关，但也与肿瘤浸润淋巴细胞增加相关。因此，靶向治疗必须针对特定癌症类型，并基于酶活性谱而非单纯转录水平进行患者分层。研究瓶颈包括需要利用单细胞测序和空间转录组学解析酶异质性，优化纳米载体的靶向特异性和安全性，以及验证CTSS抑制剂与免疫检查点阻断剂的协同效应。

2 半胱氨酸肽酶在APC抗原呈递中的分子机制

APC启动适应性免疫的核心在于有效加工外源抗原并将其加载到MHC II类分子上以激活CD4⁺ T细胞。溶酶体半胱氨酸肽酶家族作为“分子剪刀”，通过特异性切割抗原蛋白和恒定链（Ii）等关键底物，精确调控从抗原降解到免疫肽组塑造再到MHC-II-肽复合物形成和转运的全过程。

2.1 酶活性塑造免疫肽组和T细胞反应

半胱氨酸组织蛋白酶（包括CTSB、CTSL和CTSS）在MHC II类抗原呈递途径中占据中心地位，其活性直接决定抗原肽生成的效率、多样性和最终免疫原性。这些酶在溶酶体酸性环境中激活，表现出不同的底物特异性和切割动力学。在TME中，半胱氨酸组织蛋白酶对肿瘤抗原（如突变新抗原和过表达自身抗原）的降解具有独特的动力学特征。酶活性-肽库多样性-免疫原性的调控逻辑贯穿整个抗原加工级联：总体活性水平决定抗原蛋白是有限的蛋白水解生成免疫原性肽还是完全降解为无免疫活性的氨基酸；不同组织蛋白酶亚型的组合表达和协同作用极大增加了肽产物的序列多样性；生成的肽与MHC II类分子的结合亲和力差异显著，只有高亲和力肽才能形成稳定的MHC-II-肽复合物并有效呈递。CTSS在结直肠癌免疫微环境中具有双重作用，它不仅通过经典抗原加工途径影响肽段加载，还通过自噬依赖的PD-L1降解非经典地调节T细胞功能。免疫肽组的扭曲表现为：一方面，关键肿瘤新表位可能因过度降解而丢失；另一方面，正常被忽略的自身来源肽可能被异常呈递。这直接导致T细胞反应失调，表现为效应T细胞功能耗竭或调节性T细胞（Treg）不适当扩增。

2.2 恒定链降解：MHC II肽复合物形成的分子开关

2.2.1 半胱氨酸肽酶介导的恒定链（Ii）切割时序

在新合成的MHC II α/β异源二聚体与Ii链（CD74）在内质网组装形成九聚体复合物后，Ii链的逐步降解是关键事件。CTSS在Ii逐步降解中发挥不可替代的“终结者”作用，负责最终切割Ii链，从其截短产物p10中移除CLIP片段，这是整个Ii降解过程的限速步骤，也是MHC II类分子获得抗原肽加载能力的“分子开关”。从结构生物学角度看，CTSS与Ii底物的相互作用具有高度特异性。当CTSS活性被LHVS等特异性抑制剂抑制时，Ii降解停滞在CLIP阶段，导致CLIP片段持续占据MHC II类分子的肽结合槽，完全阻断后续抗原肽加载。在TME中，CTSS活性常因表达水平改变或肿瘤来源抑制因子影响而异常，导致Ii降解时机紊乱，损害APC介导的肿瘤抗原呈递。

2.2.2 MHC II-肽复合物转运和免疫突触形成

成功加载抗原肽的MHC II-肽复合物必须从内体区室定向转运至APC表面，这是与CD4⁺ T细胞相遇并启动免疫反应的先决条件。该过程高度依赖内体系统的膜动力学、适当的酸化以及微管细胞骨架网络。其他半胱氨酸肽酶家族成员如CTSX虽不直接参与抗原加工，但可通过切割细胞骨架蛋白或趋化因子受体间接调节APC形态和迁移，从而影响免疫突触形成的局部微环境。在TME中，半胱氨酸肽酶活性广泛异常会显著损害这些下游过程，即使少量抗原肽成功加工和加载，其向质膜的转运效率和膜定位也会异常，阻碍或破坏免疫突触的形成与稳定。病毒通过劫持宿主MHC I和II抗原呈递途径操纵或逃避免疫监视的机制，也从反面凸显了半胱氨酸肽酶在抗原呈递和免疫识别中的核心战略地位。

3 半胱氨酸肽酶在APC功能扩展中的作用

3.1 交叉呈递：CD8⁺ T细胞活化途径的非经典调节

3.1.1 半胱氨酸肽酶介导的逆向抗原加工（内体-胞质）

CTSL和CTSS在APC的交叉呈递途径中发挥高度精细的调节功能。CTSL通过特异性识别和切割内体膜蛋白SNX17的特定结构域，促进抗原-载体复合物高效解离，从而显著增强抗原从内体区室逃逸进入胞质空间。CTSL的完全激活需要两个紧密调控的关键步骤：首先是在内体酸性环境（pH 5.5-6.0）下发生构象重排暴露催化中心；其次是经过自催化机制去除前结构域。CTSS则通过降解内体胆固醇转运蛋白NPC1改变内体膜的脂质组成和生物物理特性，间接影响抗原逃逸。不同APC亚群的交叉呈递效率差异与其半胱氨酸肽酶表达谱和调控机制密切相关。cDC1s不仅高表达CTSL和CTSS，还低表达其内源性抑制剂胱抑素C，这为其高效的抗原加工和交叉呈递能力提供了分子基础。相反，浆细胞样树突状细胞（pDC）虽然表达相对较高水平的CTSB，但由于缺乏抗原逃逸所需的关键蛋白，其交叉呈递能力明显受限。在TME中，TAM中组织蛋白酶D过度激活可通过降解衔接蛋白AP-3破坏正常抗原运输；肿瘤细胞分泌的外泌体携带特定microRNA有效下调CTSS表达，进一步抑制交叉呈递。

3.1.2 交叉呈递与肿瘤免疫记忆的联系

半胱氨酸肽酶调控的交叉呈递质量不仅决定初始CD8⁺ T细胞活化的效率，还深刻影响效应T细胞的分化命运和免疫记忆形成质量。通过CTSS优化的交叉呈递可诱导CD8⁺ T细胞表达更高水平的记忆相关转录因子TCF1和LEF1，同时维持较低水平的效应分子，这一独特分子特征有利于干细胞样记忆T细胞（Tscm）的产生和维持。在癌症疫苗设计中，精确控制半胱氨酸肽酶活性已成为提高免疫记忆质量和持久性的关键策略。通过先进基因编辑方法特异性上调CTSS表达的树突状细胞疫苗平台，已在多种肿瘤模型中成功诱导持久的抗原特异性免疫记忆。TME中的代谢应激（如乳酸和缺氧）可通过多种复杂机制改变半胱氨酸肽酶活性，从而损害正常的免疫记忆形成。针对这些机制，研究人员开发了多种创新治疗策略，包括利用新型生物材料封装CTSS激活剂和抗原肽以实现溶酶体特异性酶活性调节，以及应用智能刺激响应纳米颗粒技术实现时空精确控制。

3.2 免疫调节网络：TLR信号和APC表型塑造

3.2.1 半胱氨酸肽酶对TLR信号通路的双重调节

半胱氨酸肽酶在TLR信号通路中发挥复杂且精细的双重调节作用，该功能取决于不同组织蛋白酶亚型在亚细胞定位、底物特异性和活性调节机制上的差异。CTSB通过特异性识别和切割dsRNA结合蛋白的特定结构域，促进dsRNA配体与TLR3受体有效结合，从而激活TLR3信号。该调节作用具有剂量依赖性：中等水平的酶活性是TLR信号启动所必需的，而过量的酶活性可能导致信号过早衰减。CTSL则通过选择性切割IKKγ/NEMO蛋白的调节结构域，直接调节NF-κB信号的持续时间和强度。在TME中，肿瘤相关成纤维细胞分泌的TGF-β可显著下调CTSB表达并上调其内源性抑制剂胱抑素B，导致TLR信号受到明显抑制；高水平活性氧（ROS）可氧化修饰CTSL活性位点关键半胱氨酸残基，使其丧失蛋白水解活性。针对这些机制，研究人员开发了CTSB响应型智能纳米颗粒系统，可在溶酶体内特异性释放TLR激动剂，实现精准药物递送。

3.2.2 APC迁移和肿瘤微环境的重编程

半胱氨酸肽酶通过多层次、多维度的调节机制影响APC的迁移能力，共同决定APC在肿瘤组织和次级淋巴器官之间的动态分布和功能状态。CTSS不仅通过降解纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原蛋白等细胞外基质成分为细胞迁移创造物理路径，还通过特异性切割趋化因子受体CCR7的胞外域增强其对配体CCL19和CCL21的敏感性。CTSX则通过特异性切割RhoGDIα上的特定位点，释放受抑制的Rho GTPase家族成员，进而激活下游ROCK信号，促进肌动蛋白应力纤维形成和细胞伪足延伸。在免疫排斥型（“冷”）肿瘤中，CTSS和CTSX表达显著降低，而其内源性抑制剂胱抑素C和胱抑素E/M显著上调，导致APC异常滞留于肿瘤基质中，无法有效迁移至引流淋巴结。相比之下，在免疫炎症型（“热”）肿瘤中，组织蛋白酶表达和活性保持相对平衡，支持正常的APC迁移和免疫功能。基于这些机制，mRNA表达系统编码突变型CTSS以及能够感知TME线索的智能纳米材料等新型治疗策略正在展现出改善APC迁移和重编程肿瘤微环境的潜力。

4 靶向半胱氨酸肽酶：从机制到癌症免疫治疗

半胱氨酸肽酶，特别是CTSB、CTSS、CTSX和CTSL等半胱氨酸组织蛋白酶，在癌症发生、进展和免疫调节中发挥关键作用。它们高度表达于许多癌症类型中，促进肿瘤细胞侵袭、转移和免疫逃避。在癌症免疫治疗中，免疫检查点阻断（ICB）虽然显示出显著疗效，但反应率仍然较低（约10%-40%），部分原因是肿瘤免疫逃避机制的复杂性。半胱氨酸组织蛋白酶被视为“热门”治疗靶点，因为它们直接参与免疫抑制过程，包括抑制抗原特异性T细胞活化、促进免疫细胞无能以及调节免疫检查点分子表达。

4.1 调节酶活性：小分子抑制剂和激活剂的开发

4.1.1 选择性抑制剂的设计原则和功能验证

选择性抑制剂的设计主要针对半胱氨酸组织蛋白酶的活性位点或变构位点，以阻断其在肿瘤免疫逃避中的作用。设计策略包括基于肽模拟的共价催化和结构导向优化。抑制剂采用“重靶向事件”策略，通过形成瞬时底物加合物实现强效酶失活。对于CTSS，其抑制剂必须考虑组织蛋白酶家族的环境依赖性生物学特性。在功能验证方面，体外细胞模型表明抑制CTSB和CTSX可损害肿瘤细胞迁移和球体生长；抑制半胱氨酸蛋白酶活性可通过阻止TAM中溶酶体半胱氨酸蛋白酶上调来增强APC功能，从而减少肿瘤抗原降解。然而，长期暴露于广谱抑制剂E64可导致CTSL代偿性上调，而选择性CTSS抑制剂LHVS在人类树突状细胞中也可诱导CTSB和CTSK上调，因此需采用联合用药方案或序贯给药策略来克服耐药性。

4.1.2 激活剂的潜在应用场景（免疫冷肿瘤）

尽管尚无直接进入临床试验的直接小分子半胱氨酸肽酶激活剂，但已有若干概念验证策略在 preclinical 模型中报道。pH敏感纳米颗粒可在酸性内体环境（pH 5.5）特异性释放Zn²⁺离子，Zn²⁺变构增强前组织蛋白酶B的自激活。在胰腺癌小鼠模型中，瘤内注射此类纳米颗粒可增加TAM中CTSB活性，恢复MHC-II抗原呈递，并将免疫“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。脂质纳米颗粒封装编码组成型活性CTSS突变体的mRNA可转染树突状细胞，增强交叉呈递并延长生存期。硫酸化糖胺聚糖可结合CTSL前肽并诱导其解离，从而选择性增加细胞外空间酶活性。由于全身激活半胱氨酸肽酶可能导致组织破坏和炎症，局部或细胞靶向递送对未来临床转化至关重要。

4.2 治疗转化：联合策略与临床应用探索

4.2.1 半胱氨酸肽酶调节与免疫检查点阻断的协同作用

半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂通过降低酶活性减弱肿瘤基质重塑和细胞侵袭，从而削弱肿瘤的免疫屏蔽；同时调节免疫细胞功能，例如抑制CTSB或CTSS可增强抗原呈递并促进CD8⁺ T细胞活化。当与PD-1/CTLA-4抑制剂联合时，这些机制产生协同效应：组织蛋白酶抑制剂增强T细胞的细胞毒功能，而ICB阻断检查点分子，共同缓解免疫抑制。在临床应用方面，非小细胞肺癌和黑色素瘤中ICB单药反应率低，而联合CTSB抑制剂可改善临床反应。安全性数据提示全身抑制组织蛋白酶可能引起自身免疫反应等不良反应，因此联合策略必须仔细平衡剂量。

4.2.2 肿瘤疫苗开发中酶功能的优化

在肿瘤疫苗设计中，半胱氨酸肽酶的功能优化通过调节抗原加工和呈递来增强疫苗的免疫原性和抗肿瘤功效。个性化肿瘤疫苗可工程化纳入酶加工的“高免疫原性肽”，并结合酶激活剂作为佐剂系统。纳米系统如Ft-E64/Hf@Lipo递送抑制剂选择性抑制半胱氨酸蛋白酶，从而增强APC的抗原负载能力。树突状细胞疫苗可通过共递送组织蛋白酶激活剂来促进DC成熟和抗原呈递，逆转肿瘤诱导的DC功能障碍。动物实验数据有力支持了这些策略的疗效，但实现酶活性的时空控制以避免脱靶效应仍是主要挑战。

5 挑战与展望

5.1 基础研究瓶颈：酶功能的细胞类型特异性和时空动态性

半胱氨酸肽酶的功能表现出显著的细胞类型依赖性。单细胞研究揭示了不同APC亚群间组织蛋白酶活性的巨大差异。为了解析时空动态性，建议的实验框架包括：使用针对CTSS、CTSL和CTSB的活性探针（ABP）对患者不同阶段的系列肿瘤活检进行染色；在原位小鼠模型中通过近红外ABP进行体内成像追踪酶活性；将空间转录组学与ABP信号共注册以关联活性酶热点与免疫细胞基因表达。初步数据显示，结直肠癌患者肿瘤浸润边缘的高CTSS活性（而非肿瘤核心）与对新辅助抗PD-1治疗的更好反应相关。

5.2 临床转化挑战：药物递送与患者分层

药物递送面临多重障碍，传统基于EPR效应的策略效率低且缺乏细胞特异性。纳米载体如装载E64的脂质体可改善靶向。患者分层策略需利用酶活性生物标志物识别最可能获益的患者。推荐算法包括：测量血清CTSS/CTSL活性比；通过多重IHC量化CD8⁺ T细胞浸润和PD-L1表达；将患者分为三组——高活性/冷肿瘤（肽酶抑制剂+ICB候选）、低活性/热肿瘤（单独ICB）和中间型（肽酶激活剂+ICB）。临床转化还面临三大挑战：递送特异性不足、长期全身抑制的安全性问题，以及冷/热肿瘤的不同处理策略。

5.3 未来方向：多维调节与新兴技术的整合

CRISPR-Cas9介导的CTSS敲除可增强MHC-II抗原呈递并与抗PD-1疗法协同。人工智能（AI）驱动的虚拟筛选已鉴定出具有纳摩尔亲和力和高选择性的新型CTSL抑制剂。将AI与多模态技术结合有望解决临床转化中的异质性问题。

5.4 争议与局限性

该领域存在若干争议和局限：单个组织蛋白酶在抗肿瘤免疫中的功能报道常相互矛盾；大多数研究依赖肿瘤匀浆或未经分选的APC群体进行批量分析，掩盖了不同APC亚群的功能异质性；绝大多数临床前数据来自动物模型，而小鼠和人类之间半胱氨酸肽酶的表达模式和调控网络存在显著差异；缺乏测量临床样本中肽酶活性的标准化检测方法；小分子抑制剂的潜在脱靶效应研究不足；存在阳性结果发表偏倚。

6 结论

半胱氨酸肽酶通过调控APC中的关键过程（从抗原加工、呈递到免疫信号传导和细胞迁移）成为抗肿瘤免疫的关键调节因子。其失调通过过度抗原降解、MHC复合物形成受损和T细胞活化抑制促进肿瘤免疫逃避。最近的进展已验证肽酶调节剂作为恢复APC功能、增强交叉呈递和重塑免疫抑制性TME的有效工具。联合策略，特别是与免疫检查点抑制剂和肿瘤疫苗的联合，在临床前模型中显示出协同抗肿瘤功效。未来的进展取决于整合多组学技术、基因编辑和纳米医学，以开发高选择性调节剂和个性化治疗方案。