综述：针对血红蛋白病相关的转录因子：来自成功干预的教训及对癌症的启示

《Molecular Oncology》：Targeting transcription factors associated with hemoglobinopathies: Lessons from successful interventions and implications for cancer

　　

镰状细胞病和癌症代表了人类疾病中根本不同的类别——一种是由β-珠蛋白（β-globin）的确定突变驱动，而另一种则通过复杂的遗传和表观遗传改变重塑细胞身份和行为而产生。尽管存在这些差异，但两种情境都说明了转录因子、染色质调控因子和顺式调控元件如何施加疾病相关的基因表达状态。在β-血红蛋白病（β-hemoglobinopathies）中，通过调节γ-珠蛋白（γ-globin, HBG1/2）调控通路，特别是破坏红系特异性BCL11A增强子，实现对胎儿血红蛋白（fetal hemoglobin）的治疗性再激活，已成为一种临床验证的策略。这些进展部分得益于HUDEP-2红系祖细胞系，它提供了一个易于处理的成体红系模型，用于鉴定胎儿血红蛋白调控因子、验证其功能以及评估相关的基因编辑和基因调控疗法。参与γ-珠蛋白沉默的许多调控因子，包括BCL11A、ZBTB7A、NuRD相关蛋白、DNMT1、KDM1A/LSD1、MYB和ATF4，也在癌症相关的转录或表观遗传网络中发挥作用。在癌症中，这些因子可以支持致癌转录、肿瘤抑制因子抑制、分化受损、应激适应、侵袭或治疗抵抗。本综述总结了HUDEP-2细胞在胎儿血红蛋白调控和血红蛋白病治疗发展方面的发现，然后讨论了这些机制如何为理解和靶向癌症中的调控依赖性提供概念上的平行点。

**1 Introduction**
HUDEP-2细胞系（human umbilical cord blood-derived erythroid progenitor cell line, HUDEP-2）的建立解决了成体红系研究缺乏稳定非恶性细胞模型的限制。该细胞源自脐带血CD34⁺造血干细胞和祖细胞（HSPCs），通过强力霉素诱导的HPV16 E6/E7表达实现条件性永生化，同时保留红系特性并主要表达成体β-珠蛋白（β-globin）。HUDEP-2细胞被广泛用于珠蛋白基因调控机制研究、β-血红蛋白病（β-hemoglobinopathies）的基因组编辑策略开发以及红系成熟通路分析。在人类红系发育中，珠蛋白基因存在严格的阶段特异性表达：胚胎期表达ζ-珠蛋白（HBZ）和ε-珠蛋白（HBE）；胎儿期ζ-珠蛋白被成体α-珠蛋白（HBA1和HBA2）替代，ε-珠蛋白被胎儿γ-珠蛋白（HBG1和HBG2）替代；出生后γ-珠蛋白表达下降，β-珠蛋白（HBB）成为主要β样链，完成从胎儿血红蛋白（HbF, α₂γ₂）到成体血红蛋白（HbA, α₂β₂）的转换。β-血红蛋白病主要包括镰状细胞病（SCD）和β-地中海贫血：SCD由HBB基因c.20A>T点突变导致β-珠蛋白第6位Glu→Val替换，产生镰状血红蛋白（HbS）并引发红细胞镰变；β-地中海贫血因β-珠蛋白合成减少或缺失导致α/β珠蛋白链失衡和无效红系生成。提高HbF水平可显著缓解疾病严重程度，这驱动了对γ-珠蛋白抑制机制的深入研究。HUDEP-2细胞因其成体珠蛋白表达谱（γ-珠蛋白沉默）成为研究胎儿血红蛋白再激活的核心模型。许多在γ-珠蛋白沉默中鉴定的调控因子（如BCL11A、ZBTB7A、NuRD相关蛋白）也在癌症中参与转录或表观遗传网络，而SCD中通过破坏BCL11A增强子实现HbF诱导的策略为癌症转录调控靶向提供了概念先例。

**2 Research discoveries enabled by HUDEP-2 cells**
HUDEP-2细胞因其成体珠蛋白表达谱和可操纵性，被用于系统鉴定胎儿γ-珠蛋白调控因子及开发基因疗法。以下重点介绍基于该模型的关键发现。

**2.1 Transcriptional regulators of fetal hemoglobin**
HUDEP-2细胞的使用鉴定了γ-珠蛋白表达的多个转录调控因子，其中许多因子（如BCL11A、ZBTB7A、NuRD复合物组分）通过共享的转录抑制机制发挥作用。

**2.1.1 BCL11A**
BCL11A（B-cell lymphoma/leukemia 11A）是一种C2H2型锌指转录因子，全基因组关联研究首次将其与HbF水平关联。后续在HUDEP-2细胞和CD34⁺细胞中的机制研究表明，BCL11A以四聚体形式招募包含MBD2a（methyl-CpG-binding protein 2a）–NuRD和PRMT5（protein arginine methyltransferase 5）的沉默复合物至HBG1和HBG2启动子，同时排除NF-Y（nuclear factor Y）和GATA1（GATA binding protein 1）等转录激活因子，从而实现抑制。高分辨率染色质占位图谱和单核苷酸诱变分析证实，BCL11A在HBG转录起始位点上游约115 bp的TGACCA基序结合是γ-珠蛋白抑制的必要且充分条件。BCL11A也能识别非经典TGCCCA基序，但其功能意义尚不明确。

**2.1.2 Regulators of BCL11A**
BCL11A的表达受多层调控。HUDEP-2细胞中鉴定出HIC2（hypermethylated in cancer 2）作为上游调控因子，通过与GATA1竞争结合BCL11A位点（+55和+64增强子）抑制其转录，HIC2在胎儿红细胞中高表达。MLL1（mixed lineage leukemia-1）组蛋白甲基转移酶复合物组分通过直接结合BCL11A启动子和增强子，维持活性染色质状态并促进BCL11A表达。HRI-eIF2α-ATF4信号轴也调控BCL11A：HRI（heme-regulated inhibitor）是eIF2α激酶，缺失后降低BCL11A表达并增加HbF；ATF4（activating transcription factor 4）通过结合BCL11A +55增强子直接激活其转录，并通过结合HBS1L-MYB（HBS1 like translational GTPase-MYB proto-oncogene）基因间增强子促进MYB表达，间接调控BCL11A。

**2.1.3 The nucleosome remodeling and deacetylase (NuRD) repressive complex**
NuRD复合物是γ-珠蛋白沉默的核心效应器。遗传扰动CHD4（chromodomain helicase DNA-binding protein 4）、MBD2、GATAD2A（GATA zinc finger domain-containing protein 2A）和HDAC2（histone deacetylase 2）等亚基可显著诱导HbF。MBD2a-NuRD复合物占据甲基化γ-珠蛋白启动子，通过核小体定位排除激活因子。BCL11A和ZBTB7A（zinc finger and BTB domain-containing protein 7a）均通过招募NuRD复合物抑制γ-珠蛋白：ZBTB7A结合HBG转录起始位点上游约200 bp的独立元件，与BCL11A协同作用，同时降低两者可实现近乎完全的HbF诱导。ZNF410（zinc finger protein 410）通过直接结合CHD4基因座的簇状调控元件选择性调控CHD4表达，其缺失降低CHD4水平并削弱NuRD依赖性抑制，同时不影响广泛红系程序。GATAD2A亚基参与形成MBD2依赖性抑制复合物，其缺失同样升高HbF。

**2.1.4 Additional transcription factor regulators**
NFIA和NFIX（nuclear factor I family）通过刺激BCL11A转录和直接结合HBG调控元件抑制γ-珠蛋白。ERF（ETS2 repressor factor）通过结合HBG基因周围调控区域抑制转录，且其敲除不影响红系分化。MAZ（MYC-associated zinc finger protein）直接结合MYB启动子驱动MYB表达，进而抑制γ-珠蛋白。

**2.1.5 Non-coding RNA regulators**
β-珠蛋白基因座内的非编码RNA调控γ-珠蛋白表达。HBBP1（hemoglobin subunit beta pseudogene 1）通过促进激活因子ELK1（ETS transcription factor ELK1）结合HBG启动子增加γ-珠蛋白转录。BGLT3（beta globin locus transcript 3）作为长链非编码RNA，通过HIF-1α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha）招募共激活因子并增强LCR-γ-珠蛋白远距离相互作用，且其表达是羟基脲、RK-701、地西他滨等HbF诱导化合物所必需。miR-6747-3p通过靶向BCL11A 3′UTR降低其表达，增加γ-珠蛋白水平。

**2.1.6 Other regulators**
BAP1（BRCA1-associated deubiquitinase 1）通过与DRED（direct repeat erythroid-definitive）复合物（含TR2/NR2C1、TR4/NR2C2、DNMT1（DNA methyltransferase 1）和LSD1（lysine-specific demethylase 1））结合，稳定其于HBE和HBG启动子，促进γ-珠蛋白抑制。SPOP（speckle type BTB/POZ protein）作为CUL3（cullin 3）E3泛素连接酶复合物的底物适配器，其缺失通过非BCL11A/ZBTB7A依赖途径诱导γ-珠蛋白表达，提示SPOP促进抑制因子降解。

**2.2 Genetic mechanisms of fetal hemoglobin (HbF) regulation**
遗传变异研究为γ-珠蛋白调控提供了重要见解，包括遗传性持续性胎儿血红蛋白（HPFH）突变、全基因组关联研究及系统基因组编辑。

**2.2.1 Transcription factor binding sites in the HBG promoters**
HPFH单核苷酸多态性（SNPs）显示γ-珠蛋白对HBG启动子微小变化高度敏感。部分突变破坏抑制因子结合位点，如?115 BCL11A位点和?200 ZBTB7A位点。另一些突变创建激活因子结合位点：?113A>G创建GATA1结合位点，?198T>C创建KLF1（KLF transcription factor 1）结合位点。系统碱基编辑还鉴定出?123T>C和?124T>C可创建新型KLF1结合位点，诱导HbF。

**2.2.2 Cis-regulatory architecture of the β-globin locus**
β-珠蛋白基因座染色质架构中，远距离超级增强子β-珠蛋白基因座控制区（LCR）通过与珠蛋白基因启动子相互作用驱动发育阶段特异性转录。缺失性HPFH研究显示，去除HBB基因第一内含子及相邻上游13.6 kb区域可增加γ-珠蛋白表达并减少LCR与HBB启动子相互作用，证实启动子竞争是珠蛋白转换的关键。HBB启动子?78 TATA盒结合蛋白（TBP）结合位点破坏后，LCR接触重定向至HBG启动子。此外，HBBP1基因座缺失和CTCF（CCCTC-binding factor）结合位点破坏均能改变染色质接触，促进γ-珠蛋白表达。

**2.2.3 Trans-acting genetic regulators of fetal hemoglobin**
结合人类遗传学和功能碱基编辑的研究发现，遗传变异可通过影响表观修饰因子或转录因子活性调控HBG表达。例如，HBG2启动子上游?1368 bp的单核苷酸插入创建FOXO3（forkhead box O3）结合位点，增加HbF并减少DNMT3A（DNA methyltransferase 3 alpha）富集及BCL11A/ZBTB7A占位。DNMT1错义突变减弱其向HBG启动子的招募，增加γ-珠蛋白。靶向腺嘌呤碱基编辑筛选鉴定出调控BCL11A增强子、MYB-HBS1L基因间区、KLF1和NFIX邻近区域的调控元件，这些元件的扰动可改变相关基因表达并调节γ-珠蛋白水平。

**2.3 Development of gene therapy approaches and technologies**
HSPC基因编辑已成为SCD和β-地中海贫血的核心治疗策略。FDA批准的CASGEVY（CRISPR/Cas9编辑BCL11A红系增强子诱导HbF）和LYFGENIA（慢病毒表达抗镰变β-珠蛋白变体β^T87Q）已进入临床。然而，当前策略未能完全解决珠蛋白失衡，推动下一代基因编辑策略开发。

**2.3.1 Novel gene editing approaches for β-hemoglobinopathies**
组合策略可提高每个修饰细胞的治疗效果。包括将抗镰变β-珠蛋白基因添加与BCL11A敲低或CRISPR/Cas9编辑结合，实现HbF和修饰成体血红蛋白同时产生。多重编辑同时靶向BCL11A增强子和HBG启动子，可产生比单一位点编辑更强的HbF诱导。对于β-地中海贫血，CRISPR/Cas9介导的α-珠蛋白减少可改善α/β珠蛋白比例，碱基编辑可精确校正致病点突变，恢复内源性β-珠蛋白表达。

**2.3.2 Novel gene editing technologies**
递送效率是红系系统的核心限制。体外转录mRNA可实现瞬时高编辑效率，而聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）纳米颗粒封装CRISPR-Cas9组分可减少电穿孔相关毒性。针对红系细胞的递送系统需结合靶向红系表面受体的机制。基因组编辑技术方面，双碱基编辑器可实现胞嘧啶和腺嘌呤转换；质粒CRISPR-Cas9结合单链寡核苷酸供体可在HUDEP-2细胞中高效引入定义序列变化。慢病毒载体中，通过β-珠蛋白启动子和LCR调控元件实现红系特异性RNAi，而系统性鉴定紧凑红系特异性调控元件（如通过高通量筛选）可优化载体设计，提高表达特性。

**3 Cancer relevance of transcriptional and epigenetic regulators affecting HbF**
γ-珠蛋白调控研究揭示了转录因子和染色质相关蛋白如何通过DNA结合、表观修饰招募和顺式调控元件控制建立稳定基因表达状态，这些机制在癌症中同样重要，维持恶性表型。

**3.1 Epigenetic regulators and malignant cell-state maintenance**
NuRD ATP酶CHD4在融合阳性横纹肌肉瘤中定位于超级增强子，维持融合癌蛋白PAX3-FOXO1结合所需的染色质可及性，支持致癌转录和肿瘤细胞存活。在结直肠癌中，CHD4通过促进DNA甲基转移酶招募和从头甲基化，维持肿瘤抑制基因的沉默。DNMT1是主要维持性DNA甲基转移酶，在急性髓系白血病（AML）中通过甲基化沉默CDH1、PTEN、BRCA1等肿瘤抑制基因，维持白血病状态；DNMT1敲低可去甲基化并重新激活RASSF1A、APC等基因，抑制肿瘤生长。KDM1A/LSD1在AML中通过占据GFI1/GFI1B相关阻遏复合物维持未分化白血病状态，其抑制或GFI1超级增强子缺失可释放增强子抑制，促进分化。

**3.2 Transcription factors in cancer-associated regulatory networks**
BCL11A在三阴性乳腺癌（TNBC）中扩增或过表达，通过激活Wnt/β-catenin信号、与DNMT1相互作用调控ISL1表达、与RBBP4/7及CHD8等染色质调控复合物相互作用，维持肿瘤干性和存活。BCL11A还通过碱基切除修复途径（与OGG1、NTHL1、Pol β相互作用）限制氧化DNA损伤和衰老。ZBTB7A在t(8;21) AML中通过突变丧失DNA结合/阻遏功能，破坏髓系分化并允许RUNX1-RUNX1T1依赖的克隆扩增。MYB在AML中通过MYB-CBP/P300共激活复合物维持白血病性调控元件活性，干扰MYB-p300相互作用可阻止转化。ERF在前列腺癌中作为肿瘤抑制因子，限制雄激素受体（AR）转录输出，其缺失扩大AR染色质占位，与ERG活化产生重叠调控状态。ATF4通过整合应激反应诱导氨基酸代谢基因（如ASNS）和HMOX1，促进肿瘤细胞存活和转移。NFIX在胶质母细胞瘤（GBM）中直接激活EZR，驱动细胞骨架重塑和迁移。MAZ在肝细胞癌（HCC）中诱导ZEB1/ZEB2促进侵袭，在胰腺导管腺癌（PDAC）中通过Cyr61/CCN1-CRAF-ERK信号促进侵袭。TR4/NR2C2在前列腺癌中通过增加EZH2表达和激活NOTCH1、SLUG、TGFβ1、MMP9等促进干细胞样细胞侵袭。

**3.3 Gene editing and gene-regulatory therapies in cancer**
破坏顺式调控元件是干扰致癌转录依赖性的策略。T-ALL中TAL1上游的体细胞非编码插入创建MYB结合的致癌超级增强子，通过CRISPR删除或表观遗传抑制可减少TAL1表达并抑制白血病细胞生长。TERT启动子突变在多种癌症中导致异常转录因子结合和端粒酶激活，CRISPR干扰或碱基编辑靶向突变启动子可抑制TERT表达和肿瘤生长。表观基因组编辑可持久沉默MGMT启动子，增敏胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺。这些策略将血红蛋白病基因疗法中的调控逻辑延伸至癌症，尽管多数癌症应用仍处于临床前阶段，需解决递送、特异性、肿瘤异质性和可逆性等问题。

**4 Conclusions**
胎儿血红蛋白调控研究展示了精细转录控制机制如何转化为治疗干预。HUDEP-2细胞等系统鉴定了γ-珠蛋白沉默的关键调控因子，包括BCL11A、ZBTB7A、NuRD相关蛋白、DNA甲基化通路及β-珠蛋白基因座内外的顺式调控元件，这些发现推动了β-血红蛋白病的基因调控疗法，证明稳定疾病相关转录状态可被治疗性重编程。这些发现对肿瘤学的相关性并非基于血红蛋白病与癌症的直接等同，而是基于共享的调控逻辑。恶性细胞状态常由异常转录因子活性、染色质重塑、增强子-启动子架构和表观遗传抑制维持，而本综述讨论的多个HbF调控因子具有情境依赖的致癌或肿瘤抑制功能。因此，HbF调控研究为鉴定调控依赖性、验证其功能后果及开发精准扰动策略提供了聚焦模型。未来将可操纵系统的机制性扰动与疾病相关癌症模型整合，可望将这些原理扩展至肿瘤学中转录回路治疗性靶向。