基于增益开关Ti:Sapphire激光的空间光谱光声显微镜用于高精度分子动力学成像

《Laser & Photonics Reviews》：Spatiospectral Photoacoustic Microscopy With Gain-Switched Ti:Sapphire Laser for High-Accuracy Molecular Dynamics Imaging

　　

光声显微镜（PAM）通过检测脉冲激光吸收产生的超声波来实现高分辨率、无标记成像。对于单光栅扫描的高保真空间光谱成像，两个光谱上明显不同的脉冲应该几乎同时到达，以保持时空相关性，并且至少有一个波长应该是可调的，以用于外源性造影剂。研究人员提出了一种由专门设计的增益开关Ti:Sapphire激光驱动的空间光谱光声显微镜（SS-PAM）。该光源提供735–855 nm的可调范围，覆盖了血红蛋白和NIR-I（近红外一区）造影剂（例如，吲哚菁绿，ICG）的吸收波段，并且通过≈150 ns的增益开关延迟与532 nm的泵浦光产生本征同步，产生用于空间光谱激发的双脉冲。SS-PAM在20–30 kHz的重复频率下运行，脉冲能量高达63 μJ，产生了超越顺序扫描或双激光方案的时间相关、高对比度激发。在体内实验中，研究人员量化了控制缺氧条件下的血红蛋白氧饱和度（sO₂），追踪了静脉注射ICG后的血管运输过程，可视化了肿瘤周围淋巴引流，并分析了肿瘤相关微血管中的氧气摄取，确立了SS-PAM作为用于同步、血管级功能和分子成像的强大平台。

光声显微镜（PAM）作为一种重要的无标记生物微结构与功能成像模态，在监测血液相关功能动力学和外源性造影剂血管运输方面具有巨大潜力。空间光谱光声显微镜（SS-PAM）旨在同时保持高空间和时间相关性的前提下比较光谱信息，这要求激发光源能够覆盖从血红蛋白敏感的可见光区到NIR-I分子造影区，并具有极小且明确的双波长脉冲时间间隔。然而，现有光源策略存在固有局限性。传统的光学参量振荡器（OPO）系统受限于低重复率和波束质量的不稳定；受激拉曼散射（SRS）光源的光谱访问受限且难以直接覆盖临床近红外造影剂ICG的吸收峰；而常规纳秒Ti:Sapphire激光则无法在单一激光架构内同时满足可见光与NIR-I双波长激发、高重复率、足够能量以及本征脉冲同步等综合要求。为了解决这些问题，研究人员开展了一项基于增益开关Ti:Sapphire激光器的SS-PAM平台研究。该研究成功实现了单次扫描下时空与能量波动高度相关的双脉冲光谱成像，能够在单根A线上采集两个波长依赖的光声信号。该平台不仅在控制缺氧条件下实现了对动静脉sO₂动态变化的实时高精度追踪，还成功监测了ICG分子的血管运输、分布、淋巴引流重塑性以及肿瘤相关微血管的局部氧代谢特征，证实了其在血管级功能和分子成像中的卓越能力。这一克服了以往多波长系统同步与稳定性限制的研究成果发表于《Laser 》期刊，为血管生理学、肿瘤代谢和淋巴成像的定量实时光声诊断提供了坚实的定量基础。

在关键技术与研究方法上，研究人员基于增益开关Ti:Sapphire激光的速率方程构建了双脉冲激发光源，通过设置特定的腔参数（如输出耦合器透射率与腔长）实现532 nm固定波长与735–855 nm可调波长间约150 ns的本征延迟，并利用色散棱镜进行调谐。成像系统整合了微机电系统（MEMS）扫描器与光学分辨率光声显微镜（OR-PAM）装置，通过共享单模光纤光路实现双波长光束传输。样本实验通过了相关动物护理与使用委员会批准，使用雌性BALB/c小鼠作为动物模型（样本队列来源：Orient Bio, Korea），分别构建了系统缺氧模型、尾静脉注射ICG血管运输模型、皮内注射ICG肿瘤淋巴模型以及HeLa细胞异种移植肿瘤模型。在信号处理阶段，应用傅里叶变换与反卷积优化算法对重叠的双脉冲光声信号进行分离与解混，结合线性模型对血氧饱和度与外源性分子浓度进行定量映射。该研究忽略具体试剂与质粒构建步骤，重点关注宏观功能与分子动态的同步定量解析。

2.1 Spatiospectral-PAM System（空间光谱-光声显微镜系统）
研究人员将增益开关Ti:Sapphire激光器与OR-PAM装置结合。532 nm泵浦激光被偏振分束器分为两路：10%能量直接作为固定波长光束，90%耦合进Ti:Sapphire腔产生735–855 nm可调波长输出，随后二者通过二色镜合并入单模光纤。测量与模拟结果显示，532 nm泵浦脉冲与Ti:sapphire输出间存在约150 ns的延迟，脉冲宽度约30 ns。该双脉冲配置在单次光栅扫描中实现了每次A线获取两个光声信号。相比于传统双扫描模式，单扫描模式下静脉sO₂测量的标准差显著降低（平均由11.1%降至3.0%），证明单扫描模式成功实现了空间光谱成像，最小化脉冲间隔并提升了血管级保真度。

2.2 Characterization of Tunable Ti:Sapphire Laser（可调谐Ti:Sapphire激光器的特性）
研究人员对激光输出特性进行了评估。在20与30 kHz重复频率下，输出能量在780–800 nm附近达到峰值63 μJ，光光转换效率最高达34%。光束在所有测试波长下保持近高斯TEM₀₀空间分布，连续工作两小时以上保持稳定。由于增益开关积聚时间存在，延迟时间在150至220 ns之间随泵浦能量增加而延长。脉冲宽度维持在33至39 ns之间。在稳定性方面，1000个连续脉冲的短期脉冲间能量波动为1.95%，1000秒内短期功率波动为0.37%，8小时长期功率波动仅为0.44%，充分证明了该光源在时间尺度上具有高度稳定性。

2.3 In Vivo Monitoring of Rapid Oxygenation Dynamics（体内快速氧合动态监测）
研究人员通过切换小鼠呼吸气体成分（99% O₂至5% O₂/94% N₂）诱发全身缺氧。利用532 nm与760 nm双脉冲激发，监测到缺氧期间动脉血氧饱和度（sO₂）从96 ± 3%急剧下降至60 ± 7%，静脉sO₂则从58 ± 6%降至32 ± 10%，动静脉响应存在约10–20秒的滞后。恢复供氧后，动静脉血氧指标均恢复至基线水平。这表明SS-PAM能够以最小时间间隔双脉冲采集，实现对快速血流动力学响应的实时、高精度、血管级特异性监测。

2.4 Simultaneous Visualization of Hemodynamic and ICG Molecular Dynamics（血流动力学与ICG分子动力学的同步可视化）
在静脉注射ICG后，研究人员使用532 nm与790 nm双脉冲对小鼠耳部血管进行成像。光谱解混成功分离出血红蛋白（C_Hb）与ICG信号。发现动脉中的C_Hb基线归一化值在注射后短暂降至≈0%（反映了基于基线归一化且处于ICG主导阶段的降低，而非血管内血红蛋白的消失），而静脉响应较晚且更为平缓。ICG信号在动脉中瞬间跃升至≈100%，随后缓慢下降；静脉中ICG则逐渐升高并在大约430秒后缓慢降低。这种延迟且平滑的静脉响应符合毛细血管传输规律，证明了系统对血流动力学与分子分布同步追踪的能力。

2.5 Dynamic Mapping for Lymphatic and Microvasculature in Tumor（肿瘤淋巴与微血管的动态映射）
研究人员向肿瘤周围淋巴系统注射ICG，利用双波长照明同时映射ICG标记的淋巴管和血红蛋白标记的血管。ICG信号在1至12分钟内沿肿瘤周围淋巴路径逐渐增强并延伸，深度编码图像显示这些淋巴管位于肿瘤核心下方。随时间推移，ICG在肿瘤下方的淋巴管中迅速清除，但在肿瘤周围路径持续滞留更长。532 nm血管信号则相对稳定。这表明SS-PAM能够提供时间对齐、高分辨率的肿瘤周围淋巴动力学解析。

2.6 Quantifying Microvasculature Oxygen Metabolism around Tumor（肿瘤周围微血管氧代谢定量分析）
通过532 nm与760 nm双脉冲数据生成肿瘤区sO₂图。深度编码图像揭示了肿瘤边界活跃的血管生成与三维轮廓重构。对比肿瘤旁正常血管与肿瘤相关供血动脉/引流静脉发现，正常组局部基于感兴趣区域（ROI）的氧提取分数（OEF）为0.523，而肿瘤相关血管由于引流静脉sO₂异常升高，局部OEF降至0.369，相对下降约29%。这反映了肿瘤微环境内血管氧气交换受损，局部摄取减少的特征，证明了SS-PAM分辨特定类别血管氧气代谢差异的高空间保真能力。

3 Discussion and Conclusion（讨论与结论）
本研究展示了由增益开关Ti:sapphire激光驱动的SS-PAM平台，能够以极短脉冲延迟（≈150 ns）传递双脉冲，保持高度空间、时间与能量波动相关性。传统双扫描成像由于时间去相关常导致静脉sO₂估算可靠性下降，本系统的单A线双波长采集克服了此限制。研究在体内验证了其对动静脉氧动力学、ICG血管运输及肿瘤相关血管氧摄取的同步监测能力。

在肿瘤区域，肿瘤生长与间质重塑压迫血管，导致局部空间异质性供氧与缺氧；肿瘤诱导生成的不正常血管连接如动静脉短路也会扰乱局部血氧。因此肿瘤旁动脉的局部表观sO₂低于正常体循环动脉。尽管光声sO₂测量受波长依赖通量等因素影响，但在同一配置采集与分析下，肿瘤相关与邻近血管间的相对差异仍具有重要的病理指示意义。此外，静脉侧更大的变异性具有生理学合理性，反映了对局部氧气摄取和微血管后血液混合的敏感性。

在技术上，尽管30 ns的脉冲宽度宽于通常的调Q光源，但未影响毛细血管级轴向分辨率。150 ns的脉冲延迟有效避免了A线光声信号叠加，且其由腔参数决定并可在成像深度范围内进行调谐。由于系统采用共享单模光纤光路配置，532 nm泵浦脉冲与可调波长脉冲在成像平面上具有可比拟的光束横向尺寸，减少了双波长激发空间失配导致的sO₂计算误差。

该Ti:Sapphire基SS-PAM平台克服了以往多波长系统的同步与稳定性限制，实现了高速、单扫描空间光谱成像，具有短脉冲间隔、稳定光谱比率与广泛分子灵活性。通过统一血红蛋白功能映射与外源性造影剂分子可视化，研究得出结论：SS-PAM为血管生理学、肿瘤代谢和淋巴成像领域的实时定量光声诊断提供了坚实的基础。