《Archives of Insect Biochemistry and Physiology》：Efficacy of Select Gene Targets for the Management of Western Flower Thrips Through RNA Interference
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西花蓟马（WFT）Frankliniella occidentalis通过直接取食损伤或传播疾病对作物造成广泛危害。当前针对该害虫的防治策略严重依赖合成杀虫剂，导致了抗性发展和环境问题等隐患。包括RNA干扰（RNAi，也称为转录后基因沉默（PTGS））在内的多
西花蓟马（WFT）Frankliniella occidentalis通过直接取食损伤或传播疾病对作物造成广泛危害。当前针对该害虫的防治策略严重依赖合成杀虫剂，导致了抗性发展和环境问题等隐患。包括RNA干扰（RNAi，也称为转录后基因沉默（PTGS））在内的多种更安全的替代方案正被广泛研究，以开发用于防治该害虫的物种特异性分子农药。然而，RNAi的成功取决于致死靶标的选择以及双链RNA（dsRNA）向靶标害虫的递送。在本研究中，研究人员通过人工饲料喂养证明了WFT对dsRNA的摄取及其在昆虫体内的分布。研究人员评估了多个候选基因靶标，从而鉴定出用于蓟马防治的有前景的RNAi靶标。此外，研究人员成功标准化了使用重组细菌表达系统进行大规模应用的dsRNA生产。研究人员还观察到取食后裸露dsRNA的降解，这很可能与蓟马取食过程相关的核酸酶活性有关，突显了RNAi效果的一个关键限制因素。总体而言，研究人员的发现支持了RNAi作为WFT靶向防治策略的潜力。研究结果强调了战略性的基因选择、改进的递送系统以及可规模化的dsRNA生产对于开发基于RNAi的有效分子生物农药的重要性。
西花蓟马（Western Flower Thrips, WFT）Frankliniella occidentalis 是一种高度入侵且经济重要的害虫，其取食和产卵造成的损伤、病毒传播能力以及快速繁殖、扩散和产生杀虫剂抗性的特性，使其成为园艺作物中持续且日益顽固的威胁。当前防治措施严重依赖化学农药，但过度依赖杀虫剂导致全球范围内抗性种群不断产生。现有杀虫剂的风险以及公众对转基因作物的普遍担忧，激发了人们对无残留、非转基因、对环境、传粉者和天敌安全的替代防治方案的需求。基于RNA的技术，特别是利用外源供给的双链RNA（dsRNA）沉默生物体内同源基因靶标的RNA干扰（RNAi），正成为现有植物保护措施的低风险、环境安全替代方案。RNAi介导的植物保护可分为宿主诱导的基因沉默（HIGS）和喷雾诱导的基因沉默（SIGS）两类。已有研究通过喂养和注射方式在F. occidentalis 中应用RNAi，但效果不一。口服递送受喂养介质组成影响，导致dsRNA稳定性和摄取效率差异；摄入的dsRNA可能在昆虫肠道中降解或无法有效到达靶组织。微注射或纳米注射等替代递送方式可产生更一致的基因沉默响应。表面施用dsRNA需要大规模合成，体外合成成本高，但可通过突变细菌生产dsRNA克服。裸露dsRNA在环境中易被紫外线辐射和昆虫取食相关的核酸酶活性降解，是实际应用的主要障碍。此外，叶片施用dsRNA的稀释问题也限制了其广泛应用，纳米颗粒技术可改善dsRNA稳定性。除有效递送外，RNAi成功还依赖于选择能诱导强烈生物学效应的合适靶基因。尽管对基于RNAi的WFT防治兴趣日益增长，仍存在关键转化差距：先前研究要么优化递送条件而未评估广泛基因靶标面板，要么通过植物介导系统评估靶标致死性而引入宿主植物混淆变量。本研究旨在通过鉴定高效基因靶标并通过人工饲料（AD）喂养评估dsRNA递送，开发基于RNAi的物种特异性生物农药策略。此外，进行了基因敲降的定量验证，评估了喂养过程中dsRNA的降解，并标准化了dsRNA的可规模化生产。利用Cy3标记dsRNA和共聚焦荧光成像，研究人员证明了dsRNA通过AD喂养被WFT摄取，并提供了其在昆虫体内部分布的视觉证据，为开发基于RNAi的分子生物农药防治F. occidentalis 提供了重要见解。研究结果发表在《Archives of Insect Biochemistry and Physiology》。
研究人员开展的研究：从昆士兰大学温室种植的西葫芦植株上采集F. occidentalis 成虫，经形态和分子鉴定（基于mtCOI序列，GenBank登录号PX248635）后建立实验室种群。使用人工饲料系统（10%蔗糖溶液）进行喂养实验，通过添加红色食用色素或吖啶橙确认取食，并用Cy3标记的绿色荧光蛋白（GFP）dsRNA结合共聚焦显微镜证实dsRNA在昆虫体内的摄取和分布。选择7个先前在其他昆虫中报道有效的基因靶标（V-ATPase-B, cactin1, cactin2, FACT, ROP, fusilli, AQP），设计含T7启动子的引物，通过体外转录合成dsRNA。通过喂养实验评估这些靶标在100或250 ng/μL浓度下引起的死亡率，并用RT-qPCR验证基因敲降效率。通过凝胶电泳评估取食后dsRNA的降解。最后，将V-ATPase-B基因片段克隆到L4440载体并转化大肠杆菌HT115，通过IPTG诱导实现细菌系统大规模生产dsRNA。
**3.1 昆虫鉴定**
通过形态学特征（触角8节、翅发育完全、单眼刚毛位于单眼三角外、腹部末端形态）和mtCOI序列与NCBI数据库比对（100%一致性），确认了F. occidentalis 的物种身份。
**3.2 人工饲料标准化与dsRNA摄取**
在初步标准化AD喂养时，发现10%蔗糖溶液在24小时内比其他浓度更易被蓟马取食，通过红色染料或吖啶橙在肠道内的存在确认了取食。将Cy3标记的GFP-dsRNA加入10%蔗糖溶液喂养后，通过共聚焦显微镜观察到昆虫体内（尤其是肠道区域）发出荧光信号，而对照昆虫无荧光，证实了dsRNA的有效摄取。
**3.3 RNAi喂养实验**
在100 ng/μL浓度下，仅V-ATPase-B-dsRNA处理引起>40%死亡率。当浓度升至250 ng/μL时，各处理死亡率显著高于对照（GFP-dsRNA和10%蔗糖），且不同dsRNA分子间死亡率差异显著（F=19.06; p<0.001）。V-ATPase-B-dsRNA和Cact1-dsRNA处理引起>50%死亡率（分别为53.3±3.3%和>50%），其次为ROP、fus、AQP和cact2处理（26.5±2.1%至约40%），而GFP-dsRNA和蔗糖对照死亡率分别为12.9±1.4%和6.9±3.7%。
**3.4 昆虫基因敲降**
喂养不同靶标dsRNA后，对应基因mRNA水平降低。与GFP-dsRNA对照相比，AQP、Cact2和FACT处理组的靶基因表达显著降低（AQP: t=8.976, p=0.0032; Cact2: t=20.51, p=0.0024; FACT: t=6.417, p=0.0128），敲降效率分别为78.8%、76.6%和71.4%。Fusilli处理组虽转录水平降低约2.0倍（50.5%敲降），但未达到统计学显著性（p=0.3598）。
**3.5 喂养实验中dsRNA的降解**
将取食后7天的残留dsRNA（FACT、fus、Cact1、AQP）与未喂养的对照dsRNA进行凝胶电泳比较，发现取食后dsRNA完全降解为弥散条带，而对照dsRNA保持完整，表明蓟马取食活动导致了dsRNA降解。
**3.6 细菌中dsRNA的表达**
将V-ATPase-B基因片段克隆至L4440载体并转化大肠杆菌HT115，经IPTG诱导后提取dsRNA，产量约为655±24.5 μg/20 mL培养液，与体外转录dsRNA对比一致，证实了细菌表达系统可规模化生产dsRNA。
讨论部分总结：本研究证实了通过人工饲料喂养使F. occidentalis 摄取dsRNA，并利用Cy3标记荧光成像提供直接视觉证据。在测试的基因靶标中，V-ATPase-B和cactin（Cact1）诱导了显著死亡率，表明其作为RNAi防治候选靶标的潜力。然而，不同靶标在敲降效率和死亡率上的差异强调了谨慎选择基因和区域特异性dsRNA设计的重要性。观察发现裸露dsRNA在取食过程中被降解，提示需要保护性配方提高稳定性。纳米颗粒递送系统可能有助于克服这一障碍。细菌表达系统的成功标准化为大规模田间应用提供了可扩展且经济可行的平台。研究结论部分翻译如下：本研究证明了RNAi作为针对WFT（F. occidentalis）的靶向有效防治策略的潜力。通过人工饲料系统，研究人员确认了dsRNA在F. occidentalis 中的摄取和细胞吸收，并通过Cy3标记成像进行了验证。在测试的基因靶标中，V-ATPase-B和cactin诱导了显著死亡率，突显其作为RNAi害虫防治候选靶标的潜力。然而，其他靶标在敲降效率和死亡率上的变异性凸显了谨慎选择基因和区域特异性dsRNA设计的必要性。重要的是，研究人员观察到取食过程中裸露dsRNA随时间降解，表明dsRNA稳定性降低，可能限制RNAi效果。这一发现强调了需要保护性配方以增强dsRNA稳定性和递送。纳米颗粒递送系统可能为未来提高dsRNA稳定性、减少递送和取食过程中的降解提供机会，这值得进一步研究。此外，细菌dsRNA生产的成功标准化为潜在田间应用提供了一个可扩展且经济高效的平台。总体而言，RNAi在蓟马中的成功应用将依赖于整合有效靶标选择、改进递送系统和可规模化dsRNA生产的多方面策略。这些发现有助于开发基于RNAi的分子生物农药，并为可持续害虫防治的未来转化研究奠定基础。
