《Journal of Virological Methods》：Performance Comparison of Rapid and Native Barcoding Methods for Oxford Nanopore Sequencing of Poliovirus Viral Protein 1 (VP1) Amplicons
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准确及时的脊髓灰质炎病毒（poliovirus）测序对于全球根除工作至关重要，特别是基于基因组分型区域——病毒蛋白1（VP1）的分子流行病学。尽管牛津纳米孔技术（ONT）测序扩展了脊髓灰质炎病毒监测的能力，但不同ONT文库制备方法（包括连接法（原生条形码）和转
准确及时的脊髓灰质炎病毒（poliovirus）测序对于全球根除工作至关重要，特别是基于基因组分型区域——病毒蛋白1（VP1）的分子流行病学。尽管牛津纳米孔技术（ONT）测序扩展了脊髓灰质炎病毒监测的能力，但不同ONT文库制备方法（包括连接法（原生条形码）和转座酶法（快速条形码））的相对性能尚未被系统评估。在本研究中，研究人员比较了快速条形码和原生条形码工作流程，对来自17份2型脊髓灰质炎病毒阳性样本的VP1扩增子进行测序，每个样本处理三次重复。原生条形码产生了显著更高的测序输出，总读取产量比快速条形码高出约2.3倍，并展现出更高的运行间重现性（R2分别为0.979-0.998 vs. 0.847-0.929；p < 0.001）。此外，原生条形码在大约7小时内产生了快速条形码总产量的80%，而快速条形码则需要大约40小时才能达到相同的输出。尽管存在这些差异，两种方法在所有样本中均产生了相同的VP1共有序列，读取质量相当（每碱基中位Q-score约为Q17-Q18）。快速条形码提供了显著的实际优势，将手动文库制备时间从200分钟减少至55分钟，每样本成本从$16.54降至$12.82，同时简化了工作流程并降低了技术复杂性。这些发现表明，对于脊髓灰质炎病毒VP1 ONT测序，测序产量可能不是下游分析结果的决定因素。因此，快速条形码代表了一种成本效益高且高效的常规脊髓灰质炎病毒监测方法，而原生条形码在需要快速数据生成或最大测序深度的应用中仍然具有优势。
**论文解读：脊髓灰质炎病毒VP1扩增子的牛津纳米孔测序中快速条形码与原生条形码方法的性能比较**
**研究背景与问题**
全球脊灰消灭行动（GPEI）自1988年启动以来，通过广泛使用口服脊灰减毒活疫苗（OPV）显著减少了野生脊灰病毒（wild poliovirus）的传播，目前仅巴基斯坦和阿富汗仍存在地方性流行。然而，OPV的持续使用导致了疫苗衍生脊灰病毒（VDPV）的出现，对根除工作构成重大挑战。急性弛缓性麻痹（AFP）监测是GPEI的核心策略，但多数感染无症状，因此环境监测作为补充手段至关重要。脊灰病毒分子特征分析依赖于病毒蛋白1（VP1）区域的测序，该区域约900个核苷酸，用于分子流行病学追踪。当前金标准算法包括细胞培养、实时逆转录PCR（rRT-PCR）和Sanger测序，但下一代测序（NGS）方法，特别是牛津纳米孔技术（ONT）测序，提供了实时数据采集和长读长优势。然而，ONT提供的不同文库制备方法——连接法（原生条形码）和转座酶法（快速条形码）——在脊灰病毒VP1测序中的相对性能尚未被系统评估。本研究旨在填补这一空白，为优化脊灰病毒监测策略提供依据。该论文发表在《Journal of Virological Methods》。
**技术方法概述**
研究人员从2016年至2018年常规脊灰病毒监测中获取了17份2型脊灰病毒阳性样本（Zhao et al., 2023）。主要技术方法包括：通过一步RT-PCR扩增VP1区域（使用引物1854F和Q8）；采用两种ONT文库制备方案——快速条形码（SQK-RBK114.96，基于转座酶片段化与条形码连接）和原生条形码（SQK-NBD114.96，基于末端修复、dA尾化、条形码连接和接头连接）；在GridION平台进行72小时测序，使用MinKNOW进行超准确碱基识别；通过Geneious Prime进行基于参考序列的组装（Sabin 2参考基因组，GenBank登录号AY184220），以多数共识法（>50%读段支持）生成共有序列，并使用MAFFT进行比对鉴定单核苷酸多态性（SNP）。
**研究结果**
**3.1 成本与工作流程比较**
通过成本计算，处理96个样本的快速条形码总成本为$1,230.40，每样本$12.82，手动制备时间约55分钟；原生条形码总成本为$1,588.05，每样本$16.54，手动制备时间约200分钟。快速条形码减少了145分钟制备时间，并简化了工作流程，消除了多个酶促和纯化步骤。
**3.2 测序输出比较**
通过17份样本的三次重复测序，原生条形码每样本产生181,746至454,006个比对读段，而快速条形码产生11,765至303,902个比对读段，原生条形码显著更高（配对t检验，p < 0.001）。原生条形码展示了更高的运行间重现性，决定系数R2范围为0.979-0.998，而快速条形码为0.847-0.929。变异系数（CV）分析显示原生条形码变异显著更低（配对t检验，p < 0.001）。尽管产量差异显著，两种方法在所有样本中均产生了相同的VP1共有序列，与之前Illumina NGS结果一致。
**3.3 测序运行指标**
通过总读取产量和Q-score分布分析，原生条形码总产量约为快速条形码的2.3倍。原生条形码在大约7小时内达到快速条形码总产量的80%，而快速条形码需约40小时。两者每碱基中位Q-score均在Q17-Q18之间，但原生条形码质量分布更一致。原生条形码产生更长的读段（平均N50为1,652 bp vs. 978 bp），与连接法保留完整扩增子一致，而转座酶法导致片段化。
**讨论与结论**
讨论部分指出，尽管原生条形码在测序产量、数据生成效率和运行间一致性方面表现更优，但这些差异并未转化为下游分析结果的改善，两种方法均产生相同的共有序列。快速条形码的简化工作流程、减少的制备时间和较低的成本使其特别适合高通量或资源有限的环境。而原生条形码在需要快速数据生成（如7小时内获得大量数据）或最大测序深度时具有优势，尤其在分析混合感染或环境样本中的低频率变异时，其长读长特性可能有助于解析不同病毒基因组。研究结论翻译如下：总体而言，两种方法均能生成相同的共有序列，这表明在脊灰病毒VP1测序背景下，增加的测序产量并不必然转化为更好的分析结果。因此，快速条形码代表了一种高效且易于获取的方法，适用于大规模或资源有限的测序工作，而原生条形码在需要快速数据获取或更高测序深度的场景中仍是一种有价值的选择。
