《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Ultrasound-Assisted NADES-Based Extraction of Spirulina Bioactives: Bioaccessibility and Intestinal Permeability Assessment Using an In Vitro Digestion/Caco-2 Cell Model and Food Application
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在本研究中，研究人员应用超声辅助提取（UAE）结合八种天然低共熔溶剂（NADES）配方回收螺旋藻抗氧化剂，并通过体外消化/Caco-2细胞模型评估了最具活性提取物在原提取液及掺入开菲尔（kefir）基质后的生物可及性和表观基底侧回收率。研究人员发现，葡萄糖:甘
在本研究中，研究人员应用超声辅助提取（UAE）结合八种天然低共熔溶剂（NADES）配方回收螺旋藻抗氧化剂，并通过体外消化/Caco-2细胞模型评估了最具活性提取物在原提取液及掺入开菲尔（kefir）基质后的生物可及性和表观基底侧回收率。研究人员发现，葡萄糖:甘油（glucose:glycerol）提取物表现出最高的色素和总酚含量（TPC），而甜菜碱:甘油（betaine:glycerol）和氯化胆碱:柠檬酸（choline chloride:citric acid）提取物表现出最高的抗氧化能力。尽管螺旋藻强化开菲尔样品的TPC显著低于单一螺旋藻样品（降低> 90%），但在消化过程中其表现出增加的表观体外酚类生物可及性，其中掺入葡萄糖:甘油提取物的开菲尔最高值达到355%。这种升高的响应可能与消化过程中Folin反应性化合物的基质相关释放、解离和转化有关，而非反映酚类化合物的实际肠道吸收。部分螺旋藻强化开菲尔样品在Caco-2细胞模型中也实现了相对较高的抗氧化剂表观基底侧回收率。这些发现凸显了NADES结合超声（ultrasonication）在增强螺旋藻抗氧化剂回收方面的潜力，并揭示开菲尔可作为改善螺旋藻源生物活性物质胃肠利用的有效载体基质。
本研究围绕螺旋藻（Limnospira platensis）作为可持续“超级食物”在高价值功能成分开发中的应用瓶颈展开。螺旋藻虽富含色素（藻蓝蛋白、叶绿素、类胡萝卜素）和多酚等生物活性物，具备抗氧化、抗菌、抗炎等功能，但其强烈的鱼腥味、深蓝绿色及涩味在食品配方中难以掩盖，限制了大规模食品应用。传统提取方法如浸渍、水蒸气蒸馏、索氏提取及常规有机溶剂（正己烷、甲醇、丙酮等）存在耗时、效率低、热敏成分分解及有机毒性的问题。绿色提取技术如超声辅助提取（UAE）与食品级天然深度低共熔溶剂（NADES）因环境友好、高效及高生物降解性成为替代方案。然而，目前关于NADES从螺旋藻回收生物活性的研究多聚焦提取效率与组分表征，缺乏对其消化后行为及跨上皮转运的探究，且非消化状态下的体外抗氧化测定可能高估复杂基质的体内潜力。因此，研究人员开展此项研究，结合NADES基UAE、开菲尔基质包埋、体外模拟胃肠消化及人结肠腺癌细胞（Caco-2）单层转运模型，系统评估螺旋藻抗氧化物的回收率、消化稳定性及肠道通透性，旨在克服感官障碍并提升胃肠利用率，为微藻基功能性益生菌饮料开发提供理论依据。该研究发表于《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》。
研究人员主要采用的关键技术方法包括：以市售土耳其螺旋藻粉为生物样本，制备八种不同氢键受体（HBA）与氢键供体（HBD）配比的NADES溶液；应用超声辅助提取（45 kHz，600 W，15 min，< 30°C）对比常规溶剂（甲醇、乙醇、水）提取生物活性物；通过HPLC定性定量酚类，分光光度法测定色素、总酚含量（TPC，Folin-Ciocalteu法）及总抗氧化能力（TAC，DPPH与CUPRAC法）；将优选提取物以5% v/v掺入商用开菲尔基质；依据Minekus协议进行体外唾液-胃-肠连续消化；利用分化Caco-2细胞单层模型（TEER监测完整性）进行细胞毒性（MTT法）及顶端至基底侧转运实验，计算表观基底侧回收率。
3 Results and Discussion
研究人员通过密度测定表征NADES理化性质，发现氯化胆碱:乙酸:水（1:1:2，NADES 7）密度最低（1041 kg/m3），甜菜碱:甘油:葡萄糖:水（1:2:4:0.5，NADES 6）最高（1190 kg/m3），符合文献范围。
在Spirulina Bioactives回收中，葡萄糖:甘油（NADES 1）在叶绿素（27.67 mg/100 mL）、藻蓝蛋白（519.98 mg/100 mL）、TPC（404.29 mg GAE/100 mL）及DPPH（85.87 mg TE/100 mL）上最高；甜菜碱:甘油（NADES 5）CUPRAC（355.64 mg TE/100 mL）最高；氯化胆碱:柠檬酸（NADES 8）DPPH（102.56 mg TE/100 mL）最高。乙醇提取类胡萝卜素最佳（24.26 mg/100 mL），多数糖基NADES未检出类胡萝卜素，因其亲水性不适非极性物。HPLC鉴定出没食子酸、表儿茶素、芦丁、槲皮素等酚类，因溶剂而异。NADES尤其甘油糖基类在极性酚类与藻蓝蛋白提取上优于常规溶剂，酸性NADES因低pH致藻蓝蛋白不稳定。
在Selected Spirulina Extracts胃肠消化评估中，胃消化显著降低各提取物TPC与抗氧化响应（p < 0.05）。肠消化后TPC微升但不显著。NADES 1肠生物可及性最高（TPC 6.05%）。CUPRAC显示NADES 8生物可及性达206.76%（超100%），因NADES促释放或转化为可检测衍生物；其余为51.65%–64.41%，示降解或相互作用。DPPH生物可及性NADES为21.31%–34.65%，水提物45.32%。
在Kefir基质消化稳定性中，强化前开菲尔TPC较原提取物降>90%，因酚类与乳蛋白氢键/疏水相互作用及酸性环境增强结合。消化后TPC显著升高，NADES 1强化开菲尔肠生物可及性达354.65%（超100%），因消化中蛋白-酚复合物解离、肽/氨基酸（酪氨酸等）释放干扰Folin试剂，非真实吸收。CUPRAC生物可及性NADES强化开菲尔为112.72%–144.78%，DPPH中NADES 8与5分别为167.35%与126.74%，同样受基质还原物影响。
在Caco-2转运中，确定最大无毒浓度（水提物、NADES 1/5为1/2稀释；NADES 8为1/5；开菲尔样为1/10）。原提取物NADES 1表观基底侧TPC回收率最高（81.88%），NADES 8 CUPRAC最高（111.86%）。强化开菲尔中，NADES 8 TPC回收率82.97%最高；水提物CUPRAC达225.05%，NADES 8为205.20%，因开菲尔释放氨基酸等还原物贡献电子转移法测定。基质包埋显著影响表观转运，但需注意非酚类物质干扰。
4 Conclusion
研究人员总结，不同NADES配方在螺旋藻生物活性回收中表现各异，葡萄糖:甘油在色素、TPC及DPPH上最优。胃肠消化中螺旋藻抗氧化物回收通常较低，但在开菲尔中较高，部分归因于开菲尔酸性基质的保护作用。食品基质不仅稳定酚类，还促进其释放与吸收，乳制品基质可护酚类免降解从而增吸收。开菲尔可作为NADES基螺旋藻提取物载体，但需进一步研究不同基质、加工条件、感官接受度及体内模型验证Caco-2转运是否对应真实吸收。未来应结合化合物特异性分析与体内模型确认。
