基于UPLC-Q-Orbitrap MS/MS的佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）和佛手瓜（Sechium edule）代谢物比较

《Food Science & Nutrition》：Comparison of the Metabolites in Fingered Citron Fruit (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle) and Chayote (Sechium edule) Based on UPLC-Q-Orbitrap MS/MS

　　

佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）是一种在中国多个主要产区栽培的药食同源柑橘类水果。然而，关于其区域代谢物变异以及与佛手瓜（Sechium edule）的化学分化（后者因中文俗名部分重叠而可能与佛手混淆，但两者在植物学上不相关）的综合信息仍然有限。在本研究中，研究人员采用非靶向UPLC-Q-Orbitrap MS/MS（超高效液相色谱-四极杆-轨道阱串联质谱）对来自浙江（CF1）、四川（CF2）、广东/广西（CF3）和云南（CF4）的佛手样品以及作为靶向鉴定对照的佛手瓜样品（CFM）进行了代谢物谱分析。共推测注释了380种代谢物，包括47种次生代谢物，其中含23种黄酮类、8种萜类、8种酚类、3种香豆素类、3种生物碱类和2种甾体类。多变量分析和层次聚类识别出65种差异代谢物（包括19种次生代谢物），这些代谢物在当前数据集中清晰地将五个样品组区分开。然而，由于C. medica与S. edule之间巨大的分类学和代谢距离以及有限的样本量，应对极高的交叉验证Q2值谨慎解读。因此，种间分离被解释为一种具有实际鉴定价值的预期化学分类学差异，而非生物学等效分类群之间的比较。苯丙氨酸代谢以及黄酮与黄酮醇生物合成途径表现出最强的名义富集，尽管两者在FDR（错误发现率）校正后均不再显著。这些结果为佛手的区域品质区分提供了代谢物参考，并识别出用于针对佛手瓜进行靶向鉴定的候选化学特征。在常规应用前，仍需使用独立样本、更多生产年份及其他潜在对照商品进行进一步验证。

**论文解读：基于UPLC-Q-Orbitrap MS/MS的佛手与佛手瓜代谢物比较分析**

**研究背景与问题**

佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）在中国是重要的药食同源柑橘类水果，主要栽培于浙江、四川、广东/广西和云南等产区，具有抗高血压、抗呼吸道感染和抗2型糖尿病等生物活性，其活性成分包括萜类、黄酮类、香豆素类和多糖。然而，关于佛手在不同产区间的代谢物变异及其与佛手瓜（Sechium edule）的化学区分信息仍十分有限。佛手瓜在中文中俗称“佛手瓜”，与佛手（“佛手”）名称部分重叠，可能导致商品混淆。尽管两者在分类学上相距甚远（佛手属于无患子目芸香科，佛手瓜属于葫芦目葫芦科），但基于实际商品鉴定需求，有必要开展针对性的化学鉴别研究。此前，佛手的挥发油和糖类成分已有较多研究，但黄酮和香豆素等次生代谢物的比较代谢组学分析尚不充分，且缺乏覆盖中国主要产区的系统比较。因此，本研究旨在通过非靶向代谢组学技术，评估佛手区域化学变异，并探索其与佛手瓜的化学鉴别特征。

**研究内容与结论**

研究人员采用非靶向UPLC-Q-Orbitrap MS/MS代谢组学方法，分析了来自浙江（CF1）、四川（CF2）、广东/广西（CF3）、云南（CF4）的四个产区佛手样品以及作为靶向鉴定对照的佛手瓜样品（CFM），每组设6个生物学重复。通过多变量统计分析（PCA、PLS-DA、OPLS-DA）、层次聚类分析（HCA）和KEGG通路富集分析，系统比较了各组间的代谢物差异。主要结论包括：①共推测注释了380种代谢物，含47种次生代谢物，其中12种次生代谢物（如3-O-甲基槲皮素、天竺葵素、花青素等）为首次在佛手中报道；②多变量分析显示，CF1与其他三个佛手组存在分离，而CFM与所有佛手组显著分离，共识别出65种差异代谢物（含19种次生代谢物）；③种间差异被解释为预期的化学分类学差异，具有实际鉴定价值，而非生物学等效比较；④苯丙氨酸代谢以及黄酮与黄酮醇生物合成通路在名义上富集最显著，但FDR校正后不再显著。该研究为佛手区域品质区分提供了代谢物参考，并筛选出针对佛手瓜鉴别的候选化学特征。论文发表在《Food Science》。

**关键技术方法**

本研究采用非靶向UPLC-Q-Orbitrap MS/MS代谢组学技术，结合主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA，经100次置换检验评估模型稳定性）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、层次聚类分析（HCA）以及基于KEGG数据库的通路富集分析（MetaboAnalyst 5.0）。样本来源包括浙江（CF1）、四川（CF2）、广东/广西（CF3）、云南（CF4）的佛手以及佛手瓜（CFM），每组6个生物学重复，样品购自当地市场，经形态学鉴定确认。代谢物注释基于MS2谱库匹配（mzCloud、HMDB、Metlin等），置信度为MSI Level 2（推测注释）。

**研究结果**

**3.1 植物化学谱（Phytochemical Profiles）**
通过QC样品验证方法可靠性（RSD<30%的峰比例>75%）。在正负离子模式下共检测到13947和5435个前体离子，最终推测注释380种代谢物，包括初级和次级代谢物。其中，47种次生代谢物涵盖23种黄酮类（如橙皮素、新橙皮苷、芦丁等）、8种萜类、8种酚类、3种香豆素类、3种生物碱类和2种甾体类。CF2（四川）和CF1（浙江）的次生代谢物相对丰度总和最高，CFM最低。12种次生代谢物为首次在佛手中推测注释。

**3.2 注释代谢物的多变量分析（Multivariate Analysis of Annotated Metabolites）**
PCA无监督分析显示，CF2、CF3、CF4聚类较近，CF1与三者分离，CFM与所有佛手组显著分离。PLS-DA和OPLS-DA进一步确认了组间分离，OPLS-DA模型的R2Y值范围为0.996~1.000，Q2值范围为0.984~0.994，但研究人员指出高Q2值需谨慎解读，因为CFM与佛手组间巨大的分类学距离以及有限的样本量可能导致预测性能被高估。共识别出65种差异代谢物（VIP>1且p<0.05），包括19种次生代谢物（11种黄酮类、3种萜类、3种酚类、1种香豆素、1种生物碱），其中CFM与CF1比较中的差异代谢物数量最多。

**3.3 层次聚类分析（HCA）**
基于65种差异代谢物的HCA显示，34种代谢物在CFM中相对丰度较高，其余代谢物在CF1~CF4间分布变异。19种次生差异代谢物的HCA进一步表明，CF1（浙江）组含较多黄酮类等次生代谢物，具有独特的次生代谢物谱。但研究人员强调，代谢物丰度本身不足以判定总体品质优势，需结合靶向定量、感官评价和生物活性分析。

**3.4 KEGG注释与代谢通路分析（KEGG Annotation and Metabolic Pathway Analysis）**
差异代谢物经KEGG注释后，通过MetaboAnalyst进行通路富集和拓扑分析。结果显示，“黄酮与黄酮醇生物合成”通路具有最高影响值（>0.6），“苯丙氨酸代谢”通路的p值最小（<0.01），但两者在FDR校正后均不再显著，因此这些通路结果应视为探索性发现。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究中的种间分离（C. medica vs. S. edule）是分类学距离的自然结果，不应视为生物学等效比较，而是作为实用鉴别分析。研究提供了佛手区域样品的代谢物参考和候选鉴别特征，但存在若干局限性：仅包含一个非柑橘类对照、样本量有限、单季采样、代谢物注释基于数据库匹配（MSI Level 2）而非标准品验证、缺乏独立外部验证和直接生物活性评估。未来需纳入更多柑橘类群和潜在混淆商品、多收获年份、靶向定量验证及独立样本集以确定候选标记的特异性和实用性。

**结论翻译**：
在本研究中，研究人员采用非靶向UPLC-Q-Orbitrap MS/MS代谢组学表征了四个区域佛手组和佛手瓜（作为靶向非柑橘类鉴别对照）的植物化学谱。共推测注释了380种代谢物，包括47种次生代谢物。据研究人员所知，12种次生代谢物为首次在佛手中推测注释。PCA、PLS-DA、OPLS-DA和层次聚类揭示了五个样品组间的明显差异，并识别出65种差异代谢物，包括19种次生代谢物。C. medica与S. edule之间的分离因两者巨大的分类学和代谢距离而属于预期结果，因此该种间比较应解释为靶向化学鉴别分析，而非生物学等效比较。CF1~CF4间的差异进一步为区域化学品质区分提供了初步信息。苯丙氨酸代谢以及黄酮与黄酮醇生物合成途径在名义p值水平上富集最强，但两者在FDR校正后均不再显著，因此这些通路结果应视为探索性。总体上，本研究为区域佛手样品提供了代谢物参考，并识别出在产品鉴别和区域品质评价中具有潜在应用价值的候选区分特征。然而，所提出的特征尚未成为经过验证的鉴别生物标志物。本研究的局限性包括仅包含一个非柑橘类对照、有限的生物学重复数、单季采样、依赖数据库级谱图匹配而未使用标准品验证（MSI Level 2），以及缺乏独立外部验证和直接生物活性评估。未来研究应纳入更多柑橘类群和潜在混淆商品、多个收获年份和生产地点、靶向定量验证以及独立样本集，以确定候选标记的特异性、可重复性和实际适用性。