枯草杆菌纳豆发酵生产富含维生素K2的乳脂

《Food Science & Nutrition》：Production of Vitamin K2 Enriched Dairy Cream by Bacillus subtilis Natto Fermentation

　　

含有适量维生素K2和纳豆激酶的食品具有多种积极的健康功效。因此，在本研究中，乳脂被用作一种广泛消费的食品，通过与枯草杆菌纳atto (BSN)发酵，向消费者引入一种新的乳制品。为此，将巴氏杀菌乳脂 (30% 脂肪)接种BSN并在不同温度 (30°C和37°C)以及孵育时间 (12、24和36 h)下发酵，随后于冷藏温度 (4°C)下保存。在发酵过程中对样品的蛋白质、铵含量、蛋白酶活性、pH值、酸度、纳豆激酶活性、维生素K2 (甲萘醌-4(menaquinone-4, MK-4)、甲萘醌-7(menaquinone-7, MK-7))以及总微生物数进行了评估。结果发现，最佳发酵条件为30°C下发酵24 h，此时MK-4和MK-7的含量分别从10.92增加至142.27 ng/g和从4.10增加至43.93 ng/g。此外，用BSN发酵乳脂导致游离铵显著减少 (从186.84降至128.36 mg/100 g)，并且在最佳样品中蛋白酶活性显著增加 (从0.003增至0.328)。另外，在整个储存期间，所有接种BSN的乳脂样品的总微生物数均显著减少 (p < 0.05)。感官评估显示，与对照组相比，发酵并未在制备的样品中引起任何不良特性。这些发现表明，BSN发酵是将普通乳脂转化为富含维生素K2和纳豆激酶的功能性产品的有效策略，为乳制品行业提供了一项极具前景的创新。

乳脂在人类饮食中占有重要地位，但由于其高水平的饱和脂肪酸和胆固醇，引发了人们对其健康影响的担忧。传统的改良方法包括混合不饱和油、分馏或使用胆固醇吸附剂等，而发酵作为一种创新的生物技术手段，不仅能保鲜食品，还能在保持感官品质的同时产生有益健康的代谢物。在众多发酵食品中，由枯草杆菌纳豆发酵大豆制成的传统日本食品纳豆因富含纤溶酶纳豆激酶和脂溶性维生素K2（特别是MK-7）而备受关注，这些化合物与心血管保护、预防骨质疏松和神经保护作用密切相关。然而，纳豆本身具有强烈的气味和风味，可能限制其消费普及。尽管以往的研究表明BSN能在多种培养基中有效产生甲萘醌类物质，且近期研究证实发酵剂能增加奶酪等乳制品中的维生素K2含量，但这些多聚焦于非乳制品基质或传统乳制品发酵剂，在BSN特异性应用于乳脂发酵方面存在明显的研究空白。因此，为解决上述问题，本研究旨在利用BSN在不同温度和时间条件下发酵巴氏杀菌乳脂（30%脂肪），以评估发酵产物的理化和功能特性、微生物安全性以及感官品质。该研究成功将普通乳脂转化为富含功能性成分的产品，为乳制品行业提供了新的创新路径。相关研究成果发表在《Food Science》上。

在关键技术方法方面，研究人员主要采用了以下几种方法：制备BSN孢子悬液接种至乳脂样品中进行发酵处理；利用凯氏定氮法和比色法分别测定蛋白质和氨(NH₄⁺)含量；采用酪蛋白消化法测定蛋白酶活性；利用纤维蛋白原溶解法评估纳豆激酶活性；运用高效液相色谱法(HPLC)结合电化学还原后的荧光检测，对MK-4(甲萘醌-4)和MK-7(甲萘醌-7)进行定量分析；通过平板计数法监控微生物总数；并利用九分快感量表对样品进行感官评价。（样本队列来源：实验所用的巴氏杀菌乳脂（30%脂肪）由伊朗大不里士的Shirin Asal食品工业公司提供）。研究采用随机区组设计和完全随机设计进行统计分析，使用最小显著差数(LSD)检验比较处理均值。

3.1 Protein Content
通过测定氮含量计算蛋白质含量发现，接种BSN的样品蛋白质含量较对照组略有增加，其中30°C下孵育24 h的样品数值最高，但各发酵乳脂样品间总体无显著差异(p < 0.05)。这可能是因为30°C下的平衡代谢状态使氮源主要导向细胞蛋白和生物质的合成，而37°C时活跃的蛋白酶可能将蛋白质部分降解为比色法无法检测的肽和氨基酸。

3.2 Ammonia (NH₄⁺) in Product
对氨含量的测定表明，所有接种BSN的样品中NH₄⁺水平显著降低(p < 0.05)，30°C孵育36 h的样品含量最低。这表明BSN将铵主动吸收用于氨基酸和核酸等细胞成分的生物合成过程，从而降低了乳脂基质中游离铵的浓度，且pH变化促进了细菌对铵的吸收。

3.3 Protease Activity Assay
对蛋白酶活性的检测显示，所有接种BSN样品的蛋白酶活性均显著高于对照组，其中30°C下孵育24 h的样品活性最高。这证实了特定的温度和孵育时间为细菌生长、代谢和酶的合成提供了最佳条件，偏离这些非最佳条件会导致酶产量显著下降。

3.4 pH Measurement
pH值测量结果显示，所有发酵样品的pH值均显著低于对照组(p < 0.05)，30°C孵育24 h的样品pH最低。这表明该条件触发产酸代谢途径效果最强，而延长孵育时间出现的非线性趋势反映了产酸与缓冲反应间建立的代谢平衡。

3.5 Acidity
酸度分析表明，与许多发酵系统常见现象相反，所有接种样品的酸度均低于对照组。30°C条件下酸度相对平衡，而在37°C时，随着孵育时间延长酸度明显下降。这表明BSN在乳脂中的酸度变化更多取决于孵育温度和持续时间，其代谢适应甚至限制了净酸化合物的产生。

3.6 Measurement of Nattokinase Activity
对纳豆激酶活性的测定发现，接种BSN的样品活性显著增加，在30°C孵育24 h的样品中达到最高值(32.87 FU/g)。这表明此时BSN处于活跃生长期，代谢通量大量导向胞外酶合成，而非最佳条件下的压力或亚最佳代谢会导致酶产量降低。

3.7 Measurement of Menaquinone-4 and MK-7 Content
通过HPLC分析MK-4和MK-7含量发现，BSN发酵能显著增加这两种维生素(p < 0.05)，并在30°C孵育24 h时达到峰值(分别为140.35 ng/g和44.61 ng/g)。从生化角度看，这表明此时异戊二烯合成途径及关键酶的运作最为高效。与其他乳制品相比，该MK-7水平显著高于常规酸奶和奶酪，证明了BSN在提高乳制品维生素K2含量上的卓越优势。

3.8 Total Microbial Count
对总微生物计数的监控表明，对照组在储存期污染微生物最高，而所有接种BSN的样品在整个储存期间微生物计数显著降低(p < 0.05)。这得益于BSN产生的聚-γ-谷氨酸和细菌素等抗微生物代谢物有效抑制了腐败微生物，从而提高了产品的微生物安全性。

3.9 Sensory Evaluation
感官评价结果显示，BSN的加入不仅未降低产品质量，反而在风味、气味和质地上有所提升。在30°C下发酵12至24 h的样品评分最高，发酵有效防止了氧化变质和异味产生，且细菌产生的生物聚合物改善了产品的结构均匀性和口感。

4 Conclusion
研究结论指出，将BSN应用于发酵乳脂生产能够制备出富含维生素K2的乳制品。该菌种的发酵作用增强了乳脂的稳定性和质地，尤其在30°C条件下表现最佳。微生物分析证实了样品具有安全的总微生物载量，BSN占据主导并有效抑制了污染物。感官评估表明，在30°C下发酵12至24 h的样品在风味、香气和整体感官上得分最高。总之，BSN提升了乳脂的功能特性、感官品质及其健康相关属性，为开发富含维生素K2和纳豆激酶的新型乳制品提供了一种极具前景的方法。同时，有必要进一步研究BSN与传统乳制品发酵剂结合的协同效应，并探讨最终成品潜在的保健功效。