饮料工业隧道式巴氏杀菌机中微生物存在与生长的调查

《JOURNAL OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION》：A Survey of the Microbial Presence and Growth in Tunnel Pasteurizers of the Beverage Industry

　　

这个描述性研究的目的是调查啤酒和饮料工业隧道式巴氏杀菌机中微生物的存在与生长。整容器巴氏杀菌用于在灌装后处理产品，以确保在没有遵循无菌程序且产品易受微生物腐败影响时的货架期稳定性。过去，由于过度微生物生长和生物膜（biofilm）形成，此类机器中报告了加工问题。也有报告称容器被工艺水重新污染。此外，这些机器产生的气溶胶可能在整个灌装操作中散布各种微生物。对八台不同机器及其周围空气的样品在饮料工业培养基上进行了评估。使用MALDI-TOF（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）和16S或ITS区域测序鉴定了培养的微生物，并采用16S宏条形码（16S metabarcoding）等分子方法评估微生物群落。在中等温度区域的工艺水中发现了高达1.00×10⁶ CFU/mL的中温微生物（mesophilic organisms）计数，整个群落主要由细菌驱动。所有样品的平均值为1.87×10⁵ CFU/mL，表明微生物负荷较高。丝状真菌和酵母计数不超过4.00×10³ CFU/mL。温度显示出每个区域如何影响微生物计数，各台机器之间存在明显差异。发现了一些具有饮料腐败潜力的微生物，如Lactococcus、Leuconostoc和Torulaspora，尽管与总体微生物负荷相比数量较低。所呈现的结果有助于理解和评估这些机器的微生物负荷以及与微生物群相关的健康和饮料腐败风险。

**论文解读：饮料工业隧道式巴氏杀菌机中微生物存在与生长的调查**

**研究背景与目的**

巴氏杀菌（pasteurization）是食品工业中延长货架期的常用方法，其中整容器巴氏杀菌（whole container pasteurization）用于对灌装密封后的产品进行处理，以确保商业无菌（commercial sterility），尤其适用于对腐败更敏感的饮料，如无醇啤酒、低酒精啤酒和啤酒混合饮料（BMB）。然而，隧道式巴氏杀菌机（tunnel pasteurizer）在运行过程中，由于工艺水（process water）的循环利用和高温环境，可能成为微生物生长和生物膜（biofilm）形成的温床。过去已有报告指出，此类机器中过度的微生物生长会导致加工问题，例如容器被工艺水重新污染，以及气溶胶（aerosol）传播微生物至灌装区域，从而对产品构成腐败风险。尽管部分研究关注了啤酒厂灌装线上的微生物群落，但对隧道式巴氏杀菌机本身作为微生物库的作用仍缺乏系统描述。因此，该研究旨在通过定性和定量方法，全面调查饮料工业隧道式巴氏杀菌机中微生物的存在与生长情况，评估其潜在的健康和饮料腐败风险，并建立行业基准。该论文发表在《JOURNAL OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION》。

**关键技术方法**

研究人员从德国6家啤酒厂的8台隧道式巴氏杀菌机中采集工艺水样品，并在机器入口和出口处采集空气样品。主要技术方法包括：使用饮料工业常用的多种培养基（如营养琼脂、麦芽汁琼脂、MRS琼脂、NBB琼脂等）进行微生物培养和计数；通过MALDI-TOF（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）和16S/ITS区域测序鉴定分离菌落；采用16S宏条形码（16S metabarcoding，靶向V3/V4区域）和ITS2宏条形码进行高通量测序（Illumina MiSeq），以分析细菌和真菌群落结构。数据经Taxonomy Informed Clustering（TIC）算法处理，并基于SILVA数据库进行物种注释。

**研究结果**

**3.1 微生物学分析**
**3.1.1 工艺水和空气采样的定量结果**：通过培养计数，发现工艺水中中温微生物（mesophilic organisms）计数范围为0至1.00×10⁶ CFU/mL，平均值为1.87×10⁵ CFU/mL，表明微生物负荷较高。真菌计数显著较低，平均为4.30×10² CFU/mL，不超过4.00×10³ CFU/mL。各机器间差异显著，其中机器1、3A和4负荷最高，机器7A和7B最低。空气样品中的微生物负荷与机器内部负荷无明确关联，可能受灌装车间卫生和空气处理影响。

**3.2 定性结果**
**3.2.1 细菌种群**：通过培养鉴定，共获得1410个细菌菌落，主要隶属于Gammaproteobacteria（γ-变形菌纲）和Alphaproteobacteria（α-变形菌纲），与先前灌装区域研究结果一致。在高温区（60°C–66°C），Bacilli（芽孢杆菌纲）比例显著增加，提示芽孢形成有助于耐热。所有机器中均分离到Pseudomonas、Enterobacter和Bacillus三个属，可能作为生物膜形成和微生物生长的指示菌。通过选择性培养基（MRS和NBB）分离到少量潜在饮料腐败细菌，包括Lactococcus、Leuconostoc和Lactobacillus，但未发现高风险的啤酒腐败菌（如Alicyclobacillus）。

**3.2.2 酵母种群**：共分离到75个酵母菌落，主要隶属于Saccharomycetes（酵母菌纲），包括Candida、Torulaspora等。数量远低于细菌，且大部分酵母未报告有饮料腐败潜力。仅少数种类（如Torulaspora delbrueckii）对无醇啤酒、啤酒混合饮料和软饮料存在风险。所有Barnettozyma和Cutaneotrichosporon分离株均来自同一台机器，提示可能从外部环境引入。

**3.2.3 16S宏条形码群体结构**：通过16S宏条形码分析，发现比培养方法更丰富的细菌多样性，包括Bacteroidia、Bdellovibrionia、Deinococci等类别，但Gammaproteobacteria仍占主导。不同机器间的群落组成差异显著，尤其是机器7和机器3呈现独特模式。宏条形码结果显示，高温区与加热区的群落相似性高于培养结果，表明非培养方法揭示了更多未被培养捕获的微生物。

**讨论与结论**

讨论部分指出，培养方法和宏条形码方法均存在偏差：培养偏向于可生长在特定培养基上的微生物，而宏条形码则受引物结合效率和PCR扩增偏向影响。高微生物负荷主要由Gammaproteobacteria和Bacilli驱动，前者可能因生物膜形成能力，后者因芽孢形成而耐热。机器间差异可能与运行时间、清洁程序和水处理有关。尽管存在潜在腐败微生物，但其数量低且分布不均，直接污染容器的风险有限，但可能通过气溶胶传播至灌装区域。建议将Pseudomonas、Enterobacter和Bacillus作为指示菌，用于监控机器卫生状况。未来需进行多时间点采样以覆盖季节性变化和操作状态影响。

**结论翻译**：对八台隧道式巴氏杀菌机的采样和分析，通过培养方法、宏条形码和化学分析，提供了机器内浮游微生物群落的现状概述。总体细菌计数高（最高达10⁶ CFU/mL），仅少数分离物为丝状真菌和单细胞真菌。群落主要由Gammaproteobacteria和Bacilli主导，可能是由于它们分别具有生物膜和芽孢形成潜力。这些特性也导致对热的一定抵抗力，解释了它们在机器中的存在。由于从所有采样机器中分离到了高计数的Pseudomonas、Enterobacter和Bacillus，它们可用作生物膜形成和微生物生长的指示指标。发现了极少数潜在饮料腐败微生物，但它们可能被传播到灌装操作的其他区域，对饮料构成风险。培养方法和宏条形码之间的差异很可能是由所用培养基的偏差引起的，这些培养基是饮料工业常用的，但对许多宏条形码鉴定的物种没有选择性。这里描述的多次机器单点采样提供了工业现状的描述性研究。对一台机器在不同操作状态、季节、换水后和启动后的多次采样将更好地支持本文提出的某些方面。这里描述的微生物群落的数量和质量为未来关于此类过程卫生以及日常操作和监控的工作提供了全面的基准。结合已建立的最大数量建议，表明在工业环境中这些建议得到良好满足或超过。